Full Text

Введение

Перипротезные инфекции (ППИ) являются наиболее опасной разновидностью послеоперационных осложнений первичного эндопротезирования, приводя к полной потере функциональных возможностей конечности или даже смерти пациента (1). Своевременная диагностика и оценка факторов риска развития ППИ может помочь избежать подобных осложнений или выбрать оптимальный алгоритм их устранения. Так, одним из важнейших факторов для последующей тактики антибиотикотерапии пациента является природа возбудителя и его характеристики, включая чувствительность к различным антимикробным препаратам. Среди возбудителей ППИ чаще других встречаются изоляты золотистого стафилококка (Staphylococcus aureus), составляя до 60% всех случаев (2). Важным для клиники является выявление источника заражения, который может быть обусловлен контаминацией во время операции, гематогенным распространением возбудителя, рецидивом предыдущей инфекции или контактным распространением возбудителя из локального очага. В каждом из этих случаев может меняться течение заболевания, ответ на антибиотикотерапию и, как следствие, исход лечения (3). В большинстве описанных в литературе исследований не был определен источник повторной инфекции, из-за чего до сих пор представления о механизмах развития реинфекции остаются мало изученными. Так, во многих работах вывод о том, что повторная инфекция вызвана тем же микроорганизмом делался исключительно на основании принадлежности бактерии к тому же виду стандартными микробиологическими тестами (4,5). Однако ввиду высокого генетического разнообразия штаммов S. aureus для точной дифференциации двух изолятов требуется более глубокое молекулярно-генетическое исследование их геномов (6).

В последние годы все чаще для исследования изолятов S. aureus, вызывающих ППИ, применяется полногеномное секвенирование (whole-genome sequencing – WGS), позволяющее определять сразу множество клинически значимых характеристик. Так, с помощью WGS возможно определить филогенетическое родство двух изолятов, наличие генетических детерминантов антибиотикорезистентности (7), а также предсказать опасность штамма по содержанию в геноме генов, кодирующих различные факторы вирулентности (8). Помимо перечисленных клинически важных характеристик, которые могут повлиять на последующую терапию пациента, данные WGS могут помочь расширить фундаментальные представления о течении заболевания. Так, сравнение геномов родственных изолятов, например, после реактивации первичной инфекции может позволить предположить новые характеристики штамма на основании приобретенных в результате горизонтального переноса генов или точечных мутаций. Для этого необходимо накопление, с одной стороны, достаточной статистики о связи различных молекулярно-генетических характеристик штаммов с патогенными свойствами возбудителя инфекции, а, с другой – подробное исследование новых выявляемых факторов вирулентности и антибиотикорезистентности. Именно такое глубокое изучение проблем ППИ поможет разрабатывать новые пути борьбы и профилактики данного вида послеоперационных осложнений (9).

В данной работе нами проведено полногеномное исследование изолятов S. aureus, вызывающих ППИ, от пациентов с первичной инфекцией, а также с реинфекцией, с целью определения источника повторного заражения и связи молекулярно-генетических характеристик изолятов с исходом лечения пациентов.

Материалы и методы

Изоляты бактерий

С 2012 по 2019 года в Новосибирском институте травматологии и ортопедии им. Я.Л. Цивьяна (Россия, г. Новосибирск) для полногеномного исследования были собраны 20 изолятов S. aureus от 13 пациентов, проходивших лечение ППИ после эндопротезирования тазобедренного сустава. Для пяти пациентов было получено от двух до трех изолятов в связи с развитием повторной перипротезной инфекции после проведенного лечения. Видовая принадлежность всех изолятов была определена стандартными микробиологическими методами. Чувствительность к антибиотикам оценивалась с помощью стандартного диско-диффузионного метода (10). Для каждого пациента были собраны дата госпитализации, диагноз и список антибиотиков, применявшихся для лечения ППИ. От всех участников исследования было получено информированное согласие, а также получено разрешение локального этического комитета Института химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения Российской академии наук.

Выделение ДНК

Для выделения ДНК из полученных чистых культур S. aureus, 50 мл клеточной культуры центрифугировали при 4000g в течение 10 минут. Осадки ресуспендировали в 180 мкл 0,15 М NaCl, после чего добавляли 200 мкг лизоцима (AppliChem, Германия) и 50 мкг РНКазы (SERVA, США) и инкубировали при комнатной температуре в течение 10 минут. После этого добавляли 600 мкл буфера для лизиса (300 мМ NaAc, pH=5,4, 40% гуанидин тиоцианат, 0,05% мочевина, 5% тритон X-100, 0,1% додецилсульфат натрия), перемешивали и инкубировали смесь при 65 °C в течение 10 минут. Далее полученный лизат переносили в спин-колонки для выделения ДНК/РНК (БиоФармЭксперт, Россия), центрифугировали 5 минут при 13000g, осаждали ДНК на колонке с помощью 50% изопропанола с 10 мМ Трис-HCl (pH=8,0) и очищали с помощью 80% этанола. ДНК смывали с колонки добавлением 100 мкл 10 мМ Трис-HCl (pH=8,0) на центр мембраны, инкубировали при 65 °C в течение 10 минут и центрифугировали при 8000g 2 минуты. Чистоту и количество ДНК оценивали спектрофотометрически по соотношению A260/A280 и значение A260. Образцы выделенной ДНК хранили при -20 °C.

Полногеномное секвенирование

Для проведения полногеномного секвенирования 100 нг образца ДНК фрагментировали с помощью ультразвука и готовили библиотеку для секвенирования по протоколу, описанному ранее (11). Для этого восстанавливали концы фрагментов с использованием 5 е.а. Т4-полинуклеотидкиназы (СибЭнзим, Россия) и 1 е.а. Т4-ДНК-полимеразы (СибЭнзим, Россия) в 1× лигазном буфере (30 мМ Трис-HCl, pH=7,8, 100 мМ MgCl₂, 10 мМ дитиотриэтол, 1 мМ аденозинтрифосфат). К полученным фрагментам присоединяли остатки дезоксиаденозина с использованием 1 е.а. фермента Klenow exo- (Thermo Scientific, США), после чего NEB-адаптеры лигировали с помощью 1.е.а. T4-ДНК-лигазы (СибЭнзим, Россия). Секвенирование полученных библиотек проводили на приборе MiniSeq (Illumina) с использованием реагентов MiniSeq High-Output reagent kit (Illumina) в соответствии с инструкцией производителя.

Анализ данных NGS

Последовательности адаптеров из демультеплексированных прочтений удаляли программой Trimmomatic версии 0.32 (12) со следующими параметрами: «leading» – 20, «trailing» – 20, «minimum length» – 30. Оставшиеся прочтения собирали в контиги de novo программой SPAdes версии 3.9.0 с параметрами по умолчанию (13). Для последующего анализа использовали файлы scaffolds.fasta. Гены и мутации, приводящие к устойчивости к антибиотикам, выявляли программой ResFinder (14); видовую принадлежность генома определяли программой KmerFinder (15). Типирование на основе мультилокусных последовательностей (MLST – multi-locus sequencing typing) проводили программой MLST tool (16). Филогенетический анализ по данным полногеномного секвенирования проводили с построением корового генома программами snippy и gubbins (https://github.com/tseemann/snippy). Визуализацию полученного филогенетического дерева проводили программой MEGA версии 10.2.4 (17). Для аннотации генов в контигах использовали программу RAST (18).

Результаты

Характеристики выборки пациентов и изолятов

Всего в исследовании приняли участие 13 пациентов с ППИ после эндопротезирования тазобедренного сустава, среди которых у восьми пациентов были собраны по одному изоляту, у трех – по два и у двух – по три. Большее число изолятов от одного и того же пациента было связано с рецидивом развития инфекционного процесса и соответственно повторной его госпитализацией. Медианное время от первичного эндопротезирования до госпитализации по причине развития ППИ составили 5 месяцев (от одной недели до 10 лет) (Таблица 1).

Таблица 1. Характеристики пациентов, принявших участие в исследовании. DAIR (debridement, antibiotics and implant retention) – хирургическая процедура, применяемая при ППИ и включающая в себя санацию очага инфекции и антибиотикотерапию с сохранением протеза.

В 5 из 11 первичных случаев госпитализации, для которых есть данные о примененных антибиотиках, проводилась терапия одновременно двумя антибиотиками; одним и тремя антибиотикам – по три случая. Для трех из четырех случаев с повторной инфекцией было назначено 3 и более антибиотиков. Наиболее часто использовался цефалоспориновый антибиотик I поколения – цефазолин (11 случаев госпитализации из 15, включая вторичные), а также гликопептид ванкомицин (6 случаев) (Таблица 2).

Таблица 2. Характеристика изолятов с указанием времени от первичного эндопротезирования до госпитализации и высевания соответствующего изолята и списком антибиотиков, полученных пациентов в стационаре, а также числом пар NGS-прочтений, которыми были секвенирования геномы. АКЦН – амикацин; ВКЦН – ванкомицин; КТРЛ – ко-тримоксазол; МПМ – меропенем; РФМЦ – рифампицин; ЦФЗН – цефазолин; ЦФТР – цефтриаксон; ЦФЦН – ципрофлоксацин; ЭРПМ – эртапенем. Н/Д – нет данных о том, какие антибиотики были использованы при терапии.

В первую очередь, исследование полученных изолятов была направлено на выявление причины рецидива и определение источника повторной инфекции: могла происходить реактивация того же штамма бактерии после перенесенной антибиотикотерапии или совершалось заражение новым штаммом. Однако для того, чтобы была возможность идентификации родственных между собой изолятов в исследование были включены и изоляты от пациентов с одной (первичной) госпитализацией по причине развития ППИ, и успешно вылеченных в период одной госпитализации, без развития рецидива ППИ в последующем.

Антибиотикорезистентность изолятов

Нуклеотидная последовательность всех геномов, кроме одного (изолят 264), была определена с достаточной точностью: показатель N50 был более 70 тысяч п.о. Поэтому все прочитанные геномы были включены в последующий анализ. Для генома изолята 264 не удалось провести только аннотацию генов de novo. Чтобы оценить распространение в исследуемой выборке генов резистентности к различным антибиотикам и оценить, насколько их наличие проявляется фенотипически, для всех геномов был проведен анализ программой ResFinder. Для большинства изолятов (17 из 20) была предположена резистентность к β-лактамам по наличию в геноме гена blaZ или mecA (Таблица 3). Для пяти случаев резистентность, предсказанная по наличию гена blaZ, совпала с фенотипической, а в одном случае изолят оказался чувствительным. Было выявлено и противоположное несовпадение: генов устойчивости к β-лактамам обнаружено в геноме не было, однако изолят был резистентным. Это может объясняться как ошибкой при фенотипическом тестировании, так и недостаточностью данных о различных механизмах резистентности.

Ни для одного из трех фенотипически резистентных к оксациллину изолятов не было выявлено генетических детерминант устойчивости. Оксациллин тоже относится к β-лактамным антибиотикам, но практически не разрушается β-лактамазой (19). Однако во всех трех случаях изоляты имели одну и ту же нуклеотидную последовательность гена blaZ, которая отличалась от последовательности для остальных изолятов чувствительных к оксациллину, кроме одного. Возможно, такой генетический вариант гена blaZ обуславливает «пограничную» устойчивость к оксациллину, описанную в литературе (19). Сравнив аминокислотные последовательности всех вариантов гена blaZ, найденных в исследуемой выборке изолятов, а также из работы Номуры и соавторов (19), было показано, что одна из аминокислотных замен встречается только в варианте изолятов с резистентностью к оксациллину – p.Thr109Ala. Данная замена близка по расположению к той, что описана в статье Номуры и соавторами, а именно p.Glu112Ala. Однако для подтверждения того, что именно эта замена и данный вариант гена обуславливают резистентность к оксациллину, необходимо проведение функциональных экспериментов с мутагенезом.

Таблица 3. Список антимикробных препаратов, к которым исследуемые изоляты были устойчивы или чувствительны по результатам диско-диффузионного метода или анализа генома. Для каждого изолята и группы антибиотиков указаны сначала данные по результатам анализа генома, через косую черту – данные фенотипического тестирования (R – резистентный, S – чувствительный, ? – изолят не тестировался). βЛ – β-лактамы; ОЦ – оксациллин; ВК – ванкомицин; ГЦ – гентамицин; ЭЦ – эритромицин; ЦИП – ципрофлоксацин; ФСГ – феникол/стрептограмин; ДЦ – доксициклин; ТМС – триметоприм/сульфометоксазол; ФЦН – фосфомицин; АЦН – амикацин. Цветом отмечены результаты, совпавшие по анализу геномов и фенотипическому тесту (зеленые и синие), не совпавшие (желтые и оранжевые), а также результаты, где устойчивость была показана только биоинформационными методами без проверки ДДТ (фиолетовый).

Другое несоответствие было выявлено для трёх изолятов резистентных согласно ДДТ к ципрофлоксацину (изоляты 212, 264 и 318), но для которых не было обнаружено соответствующих генетических детерминант. Такие несоответствия свидетельствуют о том, что оценка антибиотикорезистентности S. aureus по данным полногеномного секвенирования пока не может заменить фенотипическое тестирование изолятов ввиду неполноты понимания всех возможных механизмов резистентности к антибиотикам.

Филогенетический анализ геномов изолятов

Чтобы определить родство исследуемых изолятов Вызвавших ППИ между собой, был проведен филогенетический анализ геномов с построением корового генома. Такой подход позволяет включать большую часть генома в анализ, однако исключает участки генома уникальные для отдельных изолятов, что упрощает алгоритм анализа. Также для каждого изолята был определен генотип MLST, совпадение по которому для разных изолятов свидетельствует о родстве изолятов. Кроме того, MLST может быть использован для сравнения со штаммами, описанными в литературе (библиотеках).

Согласно филогенетическому анализу, все изоляты разделились на шесть отдельных ветвей, что совпало с результатами MLST (Рисунок 1). Преобладающим MLST был ST97 (9 изолятов из 20), который относится к клональному комплексу 97 (CC97), часто выявляемому у сельскохозяйственных животных (20–22). В отдельную ветвь были отнесены три изолята, относящихся к MLST ST30, для которых ранее была показана связь с пищевыми инфекциями (23).

Наибольший интерес представляли изоляты от пациентов с повторной перипротезной инфекцией, обозначенных на рисунке 1 одинаковым цветом. Для четырех из пяти пациентов повторная перипротезная инфекция, по-видимому, была вызвана тем же штаммом (изоляты, выделенные фиолетовым, красным, синим и оранжевым цветами), что можно клинически трактовать как рецидив ППИ, а для одного (пациент №13) ППИ вызвана штаммом от другого пациента, который был филогенетически родственным с этим штаммом, и госпитализированным приблизительно в тот же период времени (зеленый цвет). На основании этого можно предположить, что при первичной госпитализации в декабре 2013 года пациент №13 был заражен штаммом от пациента №8, который циркулировал в тот период времени в стационаре – изолят 419, и который затем был выделен у пациента №13 (изолят 3962) при госпитализации в феврале 2014 года, при этом различия в количестве мутаций было сравнительно не велико всего 218.  У пациента №13 этот штамм (изолят 3692) вызвал рецидив ППИ через 5 лет, что привело к повторной его госпитализации. При поступлении протез был удален (Операция Girdlestoune) ввиду тяжелого рецидивирующего течения перипротезной инфекции: к моменту повторной госпитализации пациент уже перенес 12 различных операций по различным медицинским показаниями, не связанных с эндопротезированием.

Рисунок 1. Результаты филогенетического анализа геномов исследуемых изолятов с построением корового генома. Номера изолятов указаны с датой госпитализации (месяц и год). Расстояния между узлами отражают генетические различия между образцами. Цветом обозначены пациенты с повторной инфекцией, число в скобках – MLST. Числа в узлах дерева указывают на уровень бутстрап-поддержки. Изоляты 3718 и 3809 использовались только в филогенетическом анализе, поскольку были от пациентов с инфекциями различными микроорганизмами.

Среди оставшихся четырех пациентов (№5,№13,№6, №9) с повторной инфекцией, вызванной тем же штаммом, были два случая, когда у пациентов эндопротез был удален из-за неэффективности лечения и рецидива перипротезной инфекции (Рисунок 2). Для пациента №5 (изоляты 379, 212 и 264) можно предположить первичное заражение внутрибольничным штаммом во время госпитализации в августе 2012 года, изолятом 153, который был высеян у другого пациента (№1), госпитализированного из-за ППИ в июле 2012 года (изолят 153). Через два месяца после купирования перипротезной инфекции, у пациента №5 произошла реактивация того же штамма (изолят 212) с клиническим проявлением рецидива ППИ, с приобретением штаммом (изолят 212) устойчивости к оксациллину и ципрофлоксацину. После завершения курса терапии антибиотиками через полгода вновь развился рецидив ППИ (повторная реактивация – изолят 264). В итоге лечение ППИ было неэффективным, и эндопротез тазобедренного сустава был удален. При этом произошло инфицирование пациентов №2 (изолят 406) и пациента №13 (изолят399) от пациента №5, с различием в числе мутаций 39 и 7, соответственно.

Рисунок 2. Родство геномов исследуемых изолятов с указанием приблизительной даты первичного эндопротезирования соответствующего пациента (треугольник) и госпитализации по причине ППИ (зеленые круги). Пунктирная линия обозначает временную шкалу для каждого пациента. Оранжевые и синие линии – филогенетическое родство двух изолятов с числом отличий в геномах менее и более 100, соответственно. Над каждой такой линией указано числом однонуклеотидных замен, инсерций и делеций, отличающих два генома. Минус в круге обозначает удаление эндопротеза, а число – номер изолята.

Для пациента №6 (изоляты 318, 359 и 412) также было проведено два курса антибиотикотерапии. Через четыре месяца после первого эпизода развития ППИ (изолят 359) – произошла реактивация того же штамма (изолят 318) и количество мутаций в геноме бактерий 4, что клинически проявлялось рецидивом ППИ. Эндопротез был сразу удален (Операция Girdlestoune), с проведением курса антибактериальной терапии. После хирургической паузы, и реэндопротезирования с последующим курсом антибиотикотерапии вновь развился рецидив инфекционного процесса, вызванный тем же штаммом (изолят 412). Об идентичности штаммов говорит небольшое число мутаций. В связи с этим проведен еще один курс антибиотикотерапии, после которого инфекционный процесс был купирован. При этом новая резистентность к антибиотикам появилась только у изолята 412 (к гентамицину и амикацину). У данного пациента (№6) была обнаружена филогенетическая связь между изолятами S. aureus с другим пациентом (№11), от которого был получен изолят 226, содержащий такие же новые гены антибиотикорезистентности, как и изолят 412, что свидетельствует о том, что все эти изоляты скорее всего имели внутрибольничный источник заражения.

У двух других пациентов (№2 и №10) с повторной инфекцией выздоровление было зарегистрировано уже после второго курса антибиотикотерапии. Развившаяся первоначальная инфекция у пациента №2 (изолят 406), по-видимому, тоже имела внутрибольничное происхождение из-за близкого филогенетического родства с изолятом 264 пациента №5. (различия между геномами всего 39 мутаций). После первого этапа терапии цефтриаксоном (1,0 г два раза в сутки) и ванкомицином (1,0 г два раз в день внутривенно) реактивация инфекции произошла только через 4 года и 10 месяцев (изолят 1063). Но, учитывая срок развития после операции, допустимо данную клиническую ситуацию рассматривать как самостоятельный гематогенный транслокационный инфекционный процесс. Комбинированная терапия цефтриаксоном (1,0 г два раз в сутки), ванкомицином (1,0 г два раза в день внутривенно), меропенемом (1,0 г три раза в сутки) и цефтаролина фосамилом (600 мг два раза в день) и ципрофлоксацином (400 мг два раза в сутки) в стационаре, и бисептолом (960 мг два раза в день 3 недели) с ципрофлоксацином (500 мг два раза в день три недели) на амбулаторном этапе, привела к купированию ППИ с сохранением эндопротеза. При этом изолят 1063 по сравнению с изолятом 406 потерял ген blaZ, сохранив устойчивость к β-лактамам и став чувствительным к оксациллину. По-видимому, за такой долгий период произошел отбор на те бактерии, которые не содержат соответствующих генов. Для пациента №10 в обоих случаях ППИ, вызванных одним и тем же штаммом, был применен цефазолин. После второго курса антибиотикотерапии ППИ была купирована, что скорее всего связано с повторной более радикальной санацией с элементами некрэктомии и заменой парой трения в варианте Double DAIR. Связь между проведенными операциями, филогенетическим родством изолятов и исходом лечения представлена в таблице 4.

Состав генов в геномах изолятов с повторной инфекцией

Все изоляты от пациентов с повторными ППИ были подвергнуты интенсивному воздействию антибиотиками в результате проведенной соответствующей терапии, в связи с чем были исследованы изменения в геноме, связанные с таким воздействием. Для двух пациентов со значительно отличающимся периодом ремиссии (4 года и 10 месяцев для пациента №10 и менее недели для пациента №2) состав генов не изменился несмотря на то, что 39 и 35 точечных мутаций, соответственно, отличали геномы изолятов между собой.

Для пациента №6, с выздоровлением в итоге, наблюдалась обратная зависимость: число точечных мутаций составило 4 и 1, а число новых генов между изолятами 359–318 и 318 – 412 составило 2 и 78, соответственно. Среди 78 генов были найдены гены, кодирующие ферменты синтеза полисахаридов капсулы, адгезины, фаговые белки, аминоглкикозид-N (6')-ацетилтрансферазу, дающую резистентность к аминогликозидам. При этом один из новых генов изолята 318 (ген, кодирующий белок фиксации (заякоривания) на поверхности клеточной стенки) был найден и в геноме изолята 412, что подтверждает их филогенетическое родство. С другой стороны, остается открытым для дальнейшего исследования вопрос об источнике новых генов в изоляте 412, поскольку большинство из них при анализе с помощью BLAST NCBI находятся в геномах других штаммов S. aureus, что подразумевает горизонтальный перенос этих генов из бактерий того же вида, которые должны были бы контактировать с изолятом, вызвавшим инфекцию.

Изолят 212 от пациента №5 содержал 7 дополнительных генов, отсутствовавших в геноме изолята 379, среди которых были найдены гены, кодирующие маннитол-1-фосфат-5-дегидрогеназу, D-маннитол-пермеазу фосфотрансферазной системы, фибронектин-связывающий белок и никазу. У этого же пациента геном изолята 264 был секвенирован с глубиной достаточной для филогенетического анализа, однако недостаточной для аннотации генов de novo. Появление новых генов, повышающих патогенность бактерий и определило, вероятно, рецидивирующее течение ППИ и ее исход в хронический остеомиелит.

Обсуждение

Используя полногеномное секвенирование, нами были исследованы 13 случаев ППИ, вызванных различными штаммами S. aureus, из которых пять были с повторным развитием ППИ (рецидив). Именно случаи с рецидивом инфекцией и являлись основным объектом исследования, поскольку их исследование улучшает наше понимание того, каким образом бактерии адаптируются к новым условиям после проведенного лечения (24). Среди всех антибиотиков наиболее часто (73% госпитализаций) применялся цефазолин в сочетании с другими антибиотиками. При этом в литературе известны случаи так называемого инокулюм-эффекта, когда минимальная ингибирующая концентрация повышается при наличии в геноме гена β-лактамазы (blaZ), способной с низкой эффективностью гидролизовать молекулы цефазолина (25,26). Ген blaZ также был обнаружен у большинства изолятов - (85%), что связано с высоким распространением резистентности штаммов S. aureus к пенициллинам. Однако нами был выявлен ряд несоответствий между результатами поиска генетических детерминантов антибиотикорезистентности в геномах изолятов и диско-диффузионным тестом, которые мы попытались объяснить. Так, было предположено, что несоответствия результатов по оксациллину могут быть связаны с особыми генетическими вариантами гена blaZ, которые могут давать пограничную резистентность к оксациллину. Данный механизм пока мало изучен в литературе, но в одной из работ было показано, что вариант β-лактамазы с заменой p.Glu112Ala имеет бόльшую эффективность в гидролизе оксациллина (19). Нами была выявлена похожая замена p.Thr109Ala, которая встречалась во всех изолятах с несовпадающими результатами по оксациллину и только у одного – с совпадающим. Однако данная находка требует более подробного исследования. Помимо разночтений по тестированию устойчивости к оксациллину нами были найдены и другие отличающиеся результаты, из-за чего стоит с осторожностью относиться к определению антибиотикорезистентности исключительно по молекулярно-генетическому тестированию: результатам полногеномного секвенирования или ПЦР.

По-видимому, существуют какие-либо дополнительные механизмы регуляции экспрессии генов или инактивации антибиотиков. Один из механизмов по выключению экспрессии гена blaZ из-за делеции в 31 нуклеотид в промоторной области, описанный в литературе (27), был нами проверен для изолята 419 (данные не показаны), однако такой делеции найдено не было, и необходим поиск альтернативных механизмов развития резистентности.

Среди собранных 20 изолятов наибольшее распространение имели штаммы клонального комплекса 97 (СС97). Многие бактерии этого клонального комплекса часто обнаруживают у сельскохозяйственных животных (20–22), а для некоторых из них показана возможность перехода от животных к человеку (28–30). Нельзя исключать возможность того, что широкое распространение в качестве внутригоспитальной инфекции эти штаммы могли получить тоже после перехода от животных к человеку с каких-либо фермерских хозяйств, тем более среди пациентов, оперированных по поводу коксартроз, половина представлена жителями сельской местности.

Нами была выявлена потенциальная цепочка заражения внутригоспитальным штаммом CC97 с 2011 по 2019 год нескольких пациентов. Но ввиду того, что для подтверждения ее существования требуется значительно больше изолятов, дальнейшая работа была сфокусирована на повторных инфекциях одних и тех же пациентов. Используя данные полногеномного секвенирования, нам удалось показать, что в четырех из пяти случаев инфекция была вызвана филогенетически родственным изолятом, изменения в геноме которых подтверждает их родство. Появление новых генов антибиотикорезистентности наблюдалось только в двух случаях из шести, что, по-видимому, связано с применением комбинаций из нескольких антимикробных препаратов, что снижало вероятность одновременного получения клеткой сразу нескольких генов. В то же время, нами отмечено частое несовпадение результатов фенотипического и генетического тестирования устойчивости к антибиотикам, что требует дальнейших более подробных исследований.

Таким образом, используя полногеномное секвенирование, нам удалось показать филогенетическое родство изолятов, полученных на протяженном временном интервале от пациентов с ППИ, том числе в случае повторной инфекции. Полученные результаты по накоплению изменений в геномах штаммов S. aureus как для впервые выявленных внутригоспитальных инфекций, так и при рецидиве, показывают, что подробное молекулярно-генетическое тестирование может помочь в выборе тактики терапии пациентов в зависимости от того, как в ответ на терапию антибиотиками изменяется геном бактерии.

В случае, если в среде присутствуют бактерии, которые вызывают ППИ и содержат в геноме гены антибиотикорезистентности, полученные в результате горизонтального переноса, то тактика лечения ППИ должна быть радикальной. Удаление эндопротеза с последующей хирургической паузой сокращает сроки терапии антибактериальными препаратами, уменьшает мутационное давление и соответственно снижает риск развития антибиотикорезистентности и повышает эффективность лечения. Последующее ревизионное эндопротезирование после хирургической паузы в этом случае представляется более обнадеживающим.

About the authors

Andrey Kechin

Institute of Chemical Biology and Fundamental Medicine of Siberian Branch of the Russian Academy of Science

Author for correspondence.
Email: a.a.kechin@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-4822-0251
SPIN-code: 9252-8834

Researcher at Laboratory of Pharmacogenomics

Россия, 630090, Russia, Novosibirsk, 8 Lavrentiev av.

Victoria Borobova

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения Российской академии наук

Email: v.borobova@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-4443-3997
Россия, 630090, Россия, г. Новосибирск, пр. ак. Лаврентьева, д. 8

Taalaibek Sheraliev

ФГБУ «Новосибирский НИИТО им.Я.Л. Цивьяна»

Email: sheraliev.taalai@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-7261-2730
Россия, 630091 , Россия, г. Новосибирск, ул Фрунзе 17

Svetlana Chretien

ФГБУ «Новосибирский НИИТО им.Я.Л. Цивьяна»

Email: ssonovo64@inbox.ru
ORCID iD: 0000-0003-0074-8062
Россия, 630091 , Россия, г. Новосибирск, ул Фрунзе 17

Irina Tromenshleger

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения Российской академии наук

Email: irina510@ngs.ru
ORCID iD: 0009-0006-9543-3547
Россия, 630090, Россия, г. Новосибирск, пр. ак. Лаврентьева, д. 8

Vitaliy Pavlov

ФГБУ «Новосибирский НИИТО им.Я.Л. Цивьяна»

Email: pavlovdoc@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-8997-7330
630091 , Россия, г. Новосибирск, ул Фрунзе 17

Maksim Filipenko

Institute of Chemical Biology and Fundamental Medicine of Siberian Branch of the Russian Academy of Science

Email: max@niboch.nsc.ru
ORCID iD: 0000-0002-8950-5368
SPIN-code: 4025-0533

доктор биологических наук, заведующий лабораторией фармакогеномики

Россия, 630090, Russia, Novosibirsk, 8 Lavrentiev av

References

Supplementary files