Случаи развития повторной перипротезной инфекции Staphylococcus aureus: реинфекция или реактивация патогена?

Полный текст

Введение

Перипротезные инфекции (ППИ) являются наиболее опасной разновидностью послеоперационных осложнений первичного эндопротезирования крупных суставов, приводя к значительной потере функциональных возможностей замененного сустава, вплоть до летального исхода [1, 2]. Своевременная диагностика и оценка факторов риска развития ППИ может помочь избежать подобных осложнений или выбрать оптимальный алгоритм их устранения. Так, одним из важнейших факторов, определяющих последующую тактику антибиотикотерапии пациента, является природа возбудителя и его характеристики, включая чувствительность к различным антимикробным препаратам. Среди возбудителей ППИ чаще других встречаются изоляты рода стафилококков (Staphylococcus spp.), преобладающим из которых является золотистый стафилококк (Staphylococcus aureus) [3, 4, 5]. Важным для клиники является выявление источника заражения, который может быть обусловлен контаминацией во время операции, гематогенным распространением возбудителя, рецидивом предыдущей инфекции или контактным распространением возбудителя из локального очага. В каждом из этих случаев может меняться течение заболевания, ответ на антибиотикотерапию и, как следствие, исход лечения [6]. В большинстве описанных в литературе исследований не был определен источник повторной инфекции, из-за чего до сих пор механизмы развития реинфекции остаются малоизученными. Так, во многих работах вывод о том, что повторная инфекция вызвана тем же микроорганизмом делался исключительно на основании принадлежности бактерии к тому же виду стандартными микробиологическими тестами [7, 8]. Однако ввиду высокого генетического разнообразия штаммов S. aureus для точной дифференциации двух изолятов требуется более глубокое молекулярно-генетическое исследование их геномов [9].

В последние годы все чаще для исследования изолятов S. aureus, вызывающих ППИ, применяется полногеномное секвенирование (whole-genome sequencing — WGS), позволяющее определять сразу множество клинически значимых характеристик. Так, с помощью полногеномного секвенирования возможно определить филогенетическое родство двух изолятов, наличие генетических детерминант антибиотикорезистентности [10], а также предсказать опасность штамма по содержанию в геноме генов, кодирующих различные факторы вирулентности [11]. Помимо перечисленных клинически важных характеристик, которые могут повлиять на последующую терапию пациента, данные полногеномного секвенирования могут помочь расширить фундаментальные представления о течении заболевания. Так, сравнение геномов родственных изолятов, например после реактивации первичной инфекции, может позволить предположить новые характеристики штамма на основании приобретенных в результате горизонтального переноса генов или точечных мутаций. Для этого необходимо накопление, с одной стороны, достаточной статистики о связи различных молекулярно-генетических характеристик штаммов с патогенными свойствами возбудителя инфекции, а с другой — подробное исследование новых выявляемых факторов вирулентности и антибиотикорезистентности. Именно такое глубокое изучение проблем ППИ поможет разработать новые пути борьбы и профилактики данного вида послеоперационных осложнений [12].

Цель — используя полногеномное секвенирование с выявлением генетических и фенотипических отличий между изолятами, изучить возможность дифференцирования случаев заражения пациентов внутрибольничной перипротезной инфекцией с перспективой обоснованного выбора тактики лечения пациентов.

Материал и методы

Изоляты бактерий

С 2012 по 2019 г. в Новосибирском институте травматологии и ортопедии им. Я.Л. Цивьяна для полногеномного исследования были собраны 20 изолятов S. aureus от 13 пациентов, проходивших лечение ППИ после эндопротезирования тазобедренного сустава. Для пяти пациентов было получено от двух до трех изолятов в связи с развитием повторной ППИ после проведенного лечения. Для выявления этиологически значимых микроорганизмов были использованы стандартные культуральные методы с использованием питательных сред (основа кровяного агара с бараньей кровью, шоколадный агар, агар Шедлера). Идентификация выделенных микроорганизмов производилась с помощью анализатора VITEK 2 Compact 30 (bioMérieux, Франция) с применением карт Vitek ID-GP, карт для определения чувствительности Vitek AST-GP67, а также системы для идентификации стафилококков и микрококков API STAPH (bioMérieux, Франция). В 2021 г. после заключения договора об идентификации микроорганизмов с помощью масс-спектрометрии с ФГБУ «ННИИТ» Минздрава России видовая принадлежность выделенных изолятов была валидирована. Бактериальные культуры хранились при -80°C в среде Лурия – Бертани с добавлением 30% глицерола.

Помимо карт Vitek AST-GP67, чувствительность к антибиотикам оценивалась с помощью стандартного диско-диффузионного метода [13]. Для постановки антибиотикограмм диско-диффузионным методом использовались диски с цефокситином (для выявления метициллинорезистентности), рифампицином, линезолидом, триметоприм-сульфаметоксазолом, левофлоксацином, ципрофлоксацином, тигециклином, гентамицином, амикацином, эритромицином, тетрациклином, клиндамицином (Bio-Rad, США). Критерии чувствительности были заданы на основании Российских клинических рекомендаций «Определение чувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам»¹, подготовленных на основе документов EUCAST Европейского комитета по определению чувствительности. Для каждого пациента были собраны дата госпитализации, диагноз и список антибиотиков, применявшихся для лечения ППИ.

Выделение ДНК

Для выделения ДНК из полученных чистых культур S. aureus 50 мл клеточной культуры центрифугировали при 4000 g в течение 10 мин. Осадки ресуспендировали в 180 мкл 0,15 М NaCl, после чего добавляли 200 мкг лизоцима (AppliChem, Германия) и 50 мкг РНКазы (SERVA, США) и инкубировали при комнатной температуре в течение 10 мин. После этого добавляли 600 мкл буфера для лизиса (300 мМ NaAc; pH = 5,4; 40% гуанидин тиоцианат; 0,05% мочевина; 5% тритон X-100; 0,1% додецилсульфат натрия), перемешивали и инкубировали смесь при 65°C в течение 10 мин. Далее полученный лизат переносили в спин-колонки для выделения ДНК/РНК (БиоФармЭксперт, Россия), центрифугировали 5 мин. при 13 000 g, осаждали ДНК на колонке с помощью 50% изопропанола с 10 мМ Трис-HCl (pH = 8,0) и очищали с помощью 80% этанола. ДНК смывали с колонки добавлением 100 мкл 10 мМ Трис-HCl (pH = 8,0) на центр мембраны, инкубировали при 65°C в течение 10 мин. и центрифугировали при 8000 g 2 мин. Чистоту и количество ДНК оценивали спектрофотометрически по соотношению A260/A280 и значению A260. Образцы выделенной ДНК хранили при -20°C.

Полногеномное секвенирование

Для проведения полногеномного секвенирования 100 нг образца ДНК фрагментировали с помощью ультразвука и готовили библиотеку для секвенирования по протоколу, описанному ранее [14]. Для этого восстанавливали концы фрагментов с использованием 5 е.а. Т4-полинуклеотидкиназы (СибЭнзим, Россия) и 1 е.а. Т4-ДНК-полимеразы (СибЭнзим, Россия) в 1 × лигазном буфере (30 мМ Трис-HCl; pH = 7,8; 100 мМ MgCl₂; 10 мМ дитиотриэтол; 1 мМ аденозинтрифосфат). К полученным фрагментам присоединяли остатки дезоксиаденозина с использованием 1 е.а. фермента Klenow exo- (Thermo Scientific, США), после чего NEB-адаптеры лигировали с помощью 1 е.а. T4-ДНК-лигазы (СибЭнзим, Россия). Секвенирование полученных библиотек проводили на приборе MiniSeq (Illumina) с использованием реагентов MiniSeq High-Output reagent kit (300 циклов, 2×150 п.о.) (Illumina) в соответствии с инструкцией производителя.

Анализ данных NGS

Последовательности адаптеров из демультиплексированных прочтений удаляли программой Trimmomatic версии 0.32 [15] со следующими параметрами: «leading» — 20, «trailing» — 20, «minimum length» — 30. Оставшиеся прочтения собирали в контиги de novo программой SPAdes версии 3.9.0 с параметрами по умолчанию [16]. Для последующего анализа использовали файлы scaffolds.fasta. Гены и мутации, приводящие к устойчивости к антибиотикам, выявляли программой ResFinder [17], видовую принадлежность генома определяли программой KmerFinder [18]. Типирование на основе мультилокусных последовательностей (MLST — multi-locus sequencing typing) проводили программой MLST tool [19]. Помимо ResFinder, устойчивость к β-лактамным препаратам была проверена и по наличию мутаций в генах gdpP и pbp4, которые также могут быть связаны с резистентностью к цефалоспоринам [20]. Филогенетический анализ по данным полногеномного секвенирования проводили с построением корового генома одновременно для геномов всех изолятов программами snippy (https://github.com/tseemann/snippy) и FastTree 2 [21]. В качестве референса использовался геном Staphylococcus aureus subsp. aureus NCTC 8325 (сборка генома NC_007795.1). Общее число полиморфных позиций из корового генома, включенных в филогенетический анализ, составило 23315. Число мутаций между геномами изолятов оценивали по этому списку. Визуализацию полученного филогенетического дерева проводили программой MEGA версии 10.2.4 [22]. Для аннотации генов в контигах использовали программу RAST [23]. Определение spa-типов проводили с помощью программы spaTyper (https://github.com/HCGB-IGTP/spaTyper) по базе данных Ridom SpaServer (http://spaserver.ridom.de/). SSCmec-тип был определен программой SCCmecFinder-1.2 [24].

Статистический анализ

Вычисление медианы и квартилей производили с помощью стандартного Python-пакета math. Уровень бутстрап-поддержки в филогенетическом анализе был получен из результатов построения филогенетического дерева в программе FastTree 2.

Результаты

Характеристики выборки пациентов и изолятов

Всего в исследовании приняли участие 13 пациентов с ППИ после эндопротезирования тазобедренного сустава, из которых у восьми пациентов были собраны по одному изоляту, у трех — по два и у двух — по три. Большее число изолятов от одного и того же пациента было связано с рецидивом развития инфекционного процесса и соответственно повторной госпитализацией. Медианное время от первичного эндопротезирования до госпитализации по причине развития ППИ составило 5 мес. (от 1 нед. до 10 лет) (табл. 1).

 

Таблица 1

Характеристики пациентов, принявших участие в исследовании

Характеристика		Значения
Возраст, Me [Q1-Q3]		45 [39–58]
Мужской пол, n (%)		8 (62)
Время от операции до постановки диагноза	<30 дней 91–365 дней >365 дней	4 6 2
Основная стратегия лечения	DAIR Двухэтапное лечение Операция по Girdlestone	2 6 7 с заменой (4 случая) или без замены (3) протеза

DAIR (debridement, antibiotics and implant retention) — хирургическая процедура, применяемая при ППИ и включающая санацию очага инфекции и антибиотикотерапию с сохранением протеза.

 

В 5 из 11 первичных случаев госпитализации, для которых есть данные о примененных антибиотиках, проводилась терапия одновременно двумя антибиотиками; одним и тремя антибиотиками — по три случая. В трех из четырех случаев с повторной инфекцией было назначено 3 и более антибиотиков. Наиболее часто использовался цефалоспориновый антибиотик I поколения — цефазолин (11 случаев госпитализации из 15, включая вторичные), а также гликопептид ванкомицин (6 случаев) (табл. 2).

 

Таблица 2

Характеристика изолятов S. aureus с указанием времени от первичного эндопротезирования до госпитализации и высевания соответствующего изолята и списком антибиотиков, полученных пациентов в стационаре, а также числом пар NGS-прочтений, которыми были секвенирования геномы

Номер пациента	Номер изолята	Время от первичного эндопротезирования до госпитализации	Терапия антибиотиками	Число пар NGS-прочтений
1	153	2 года	ВКЦН; ЦФЦН	1658796
2	406	4 нед.	ВЦКН; ЦФТР	1355447
2	1063	4 года	МПМ; ЦФТР; ЦФЦН	3043924
5	379	10 мес.	н/д	2289340
5	212	1 год	ВКЦН; ЦФЗН	487278
5	264	17 мес.	ВКЦН; ЦФЗН; КТРЛ; РФМЦ	88448
6	359	4 мес.	н/д	385875
6	318	5 мес.	н/д	759876
6	412	7 мес.	н/д	1690858
7	310	1 год	АКЦН; ВКЦН; ЦФЗН	887505
8	419	4 мес.	АКЦН; ЦФЗН	5248835
9	3716	1 нед.	КТРЛ; ЦФЗН; ЭРПМ	2264877
10	326	4 нед.	ЦФЗН	1326171
10	348	1 мес.	ЦФЗН	648313
11	226	3 нед.	ВКЦН	564691
13	399	6 нед.	ВКЦН; ЦФЗН; ЦФЦН	1794654
13	3692	5 лет	КТРЛ; ЦФЗН; ЦФЦН	2233867
14	217	11 мес.	АКЦН; ЦФЗН	2128946
17	3825	5 мес.	ЦФЗН	322697
18	3808	10 лет	н/д	3155607

АКЦН — амикацин; ВКЦН — ванкомицин; КТРЛ — ко-тримоксазол; МПМ — меропенем; РФМЦ — рифампицин; ЦФЗН — цефазолин; ЦФТР — цефтриаксон; ЦФЦН — ципрофлоксацин; ЭРПМ — эртапенем; н/д — нет данных о том, какие антибиотики были использованы при терапии.

 

В первую очередь, исследование полученных изолятов S. aureus была направлено на выявление причины рецидива и определение источника повторной инфекции: могла происходить реактивация того же штамма бактерии после перенесенной антибиотикотерапии или совершалось заражение новым штаммом. Однако для того, чтобы была возможность идентификации родственных между собой изолятов, в исследование были включены и изоляты от пациентов с одной (первичной) госпитализацией по причине развития ППИ и успешно вылеченных в период одной госпитализации без развития рецидива ППИ при последующем наблюдении в течение двух лет и более.

Антибиотикорезистентность изолятов

Нуклеотидная последовательность всех геномов, кроме одного (изолят 264), была определена с достаточной точностью: показатель N 50 был более 70 тыс. п.о. Поэтому все прочитанные геномы были включены в последующий анализ. Для генома изолята 264 ввиду недостаточного объема данных секвенирования были проведены все типы анализа, кроме аннотации генов de novo. Чтобы оценить распространение в исследуемой выборке генов резистентности к различным антибиотикам и то, насколько их наличие проявляется фенотипически, для всех геномов был проведен анализ программой ResFinder. Для большинства изолятов (17 из 20) была предположена резистентность к β-лактамам по наличию в геноме гена blaZ или mecA (табл. 3). Все mec-содержащие изоляты (226, 318, 359 и 412) содержали ген mecA и относились к типу SSCmec IVc (2B). В пяти случаях резистентность, предсказанная по наличию гена blaZ, совпала с фенотипической, а в одном случае изолят оказался чувствительным. Было выявлено и противоположное несовпадение: генов устойчивости к β-лактамам обнаружено в геноме не было, однако изолят был резистентным. Это может объясняться как ошибкой при фенотипическом тестировании, так и недостаточностью данных о различных механизмах резистентности.

 

Таблица 3

Список антимикробных препаратов, к которым исследуемые изоляты были устойчивы или чувствительны по результатам диско-диффузионного метода, карт для определения чувствительности Vitek AST-GP67 или анализа генома

Для каждого изолята и группы антибиотиков указаны сначала данные по результатам анализа генома, через косую черту — данные фенотипического тестирования (R — резистентный, S — чувствительный, ? — изолят не тестировался). БП — бензилпенициллин, ЦФ — цефокситин, ВК — ванкомицин, ГЦ — гентамицин, ЭЦ — эритромицин, ЦФЦН — ципрофлоксацин, ХФ — хлорамфеникол, ТЦ — тобрамицин, АЦН — амикацин. Цветом отмечены результаты, совпавшие по анализу геномов и фенотипическому тесту (зеленые и синие), не совпавшие (желтые и оранжевые), а также результаты, где устойчивость была показана только биоинформационными методами без проверки диско-диффузионным методом (фиолетовый). Резистентность к доксициклину, триметоприму, сульфометаксазолу и фосфомицину определялась только методами in silico: все изоляты были чувствительны к перечисленным антибиотикам.

 

Помимо анализа с помощью ResFinder, который предсказывает резистентность к β-лактамам по наличию в геноме гена blaZ или mecA, вручную был проведен поиск мутаций в генах gdpP и pbp4. Ранее для некоторых цефалоспоринов было показано появление резистентности, по механизму не зависящей от генов blaZ и mecA [25, 26]. В исследуемой выборке были найдены две мутации, ранее описанные в резистентных штаммах: c.-298C>T (в промоторе) и p.Asp98Glu в гене pbp4 изолята 217, который фенотипически был чувствителен к цефокситину. Скорее всего, это связано с тем, что по вышеперечисленным mecA-независимым механизмам в литературе в большинстве случаев пока только представлены данные о встречаемости этих мутаций в резистентных штаммах, однако не было проведено экспериментов, демонстрирующих, что именно эти мутации приводят к развитию резистентности. Исключение составляют, например, дупликация 36 п.о. и делеция 90 п.о. в промоторной области гена pbp4, для которых показана связь с высокой экспрессией гена, вследствие чего изменяется структура пептидогликана клеточной стенки, что и ведет к устойчивости [26, 27].

Другое несоответствие было выявлено для трех изолятов чувствительных, согласно диско-диффузионному методу, к амикацину (изоляты 217, 226 и 412), но у которых был обнаружен ген aac(6’)-aph(2’’), что соответствует резистентности этих изолятов к гентамицину и тобрамицину. Такие несоответствия свидетельствуют о том, что оценка антибиотикорезистентности S. aureus по данным полногеномного секвенирования пока не может заменить фенотипическое тестирование изолятов ввиду неполноты понимания всех возможных механизмов резистентности к антибиотикам. Для всех изолятов, резистентных к ципрофлоксацину (226, 318, 359 и 412), были выявлены две мутации в генах gyrA (p.Ser84Leu) и grlA (другое название гена — parC, p.Ser80Phe).

Филогенетический анализ геномов изолятов

Чтобы определить родство исследуемых изолятов, вызвавших ППИ, между собой, был проведен филогенетический анализ геномов с построением корового генома. Такой подход позволяет включать большую часть генома в анализ, однако исключает участки генома уникальные для отдельных изолятов, что упрощает алгоритм анализа. Также для каждого изолята был определен генотип MLST, совпадение по которому для разных изолятов свидетельствует о родстве изолятов. Кроме того, MLST может быть использован для сравнения со штаммами, описанными в литературе.

Согласно филогенетическому анализу, все изоляты разделились на шесть отдельных ветвей, что совпало с результатами MLST (рис. 1). Преобладающим MLST был ST97 (9 изолятов из 20), который относится к клональному комплексу 97 (CC97), часто выявляемому у сельскохозяйственных животных [28, 29, 30]. В отдельную ветвь были отнесены три изолята, относящиеся к MLST ST30, для которых ранее была показана связь с пищевыми инфекциями [31].

 

Рис. 1. Результаты филогенетического анализа геномов исследуемых изолятов с построением корового генома. Номера изолятов указаны с датой госпитализации (месяц и год) и номерами пациентов. Звездочкой отмечены мультирезистентные изоляты. Расстояния между узлами отражают генетические различия между образцами. Цветом обозначены пациенты с повторной инфекцией: для изолятов от одного пациента использован одинаковый цвет, число в скобках — MLST. Числа в узлах дерева указывают на уровень бутстрап-поддержки. Изоляты 3718 и 3809 использовались только в филогенетическом анализе, поскольку были получены от пациентов с инфекциями различными микроорганизмами

Figure 1. Results of phylogenetic analysis of genomes of the isolates performed using core genome reconstruction. Isolate numbers are indicated with the date of hospital admission (month and year) and patient numbers. Multidrug-resistant isolates are marked with an asterisk. The distances between nodes reflect genetic differences between the samples. Colors represent patients with recurrent infections: isolates from the same patient are shown in the same color, with the number in parentheses indicating the MLST. Numbers at the nodes of the tree indicate bootstrap support levels. Isolates 3718 and 3809 were used only in the phylogenetic analysis, as they were obtained from patients with infections caused by different microorganisms

 

Наибольший интерес представляли изоляты от пациентов с повторной ППИ, обозначенных на рисунке 1 одинаковым цветом. У четырех из пяти пациентов повторная ППИ, по-видимому, была вызвана тем же штаммом (изоляты, выделенные фиолетовым, красным, синим и оранжевым цветами), что можно клинически трактовать как рецидив ППИ, а у одного (пациент № 13) ППИ вызвана штаммом от другого пациента, который был филогенетически родственным с этим штаммом и госпитализированным приблизительно в тот же период времени (зеленый цвет). На основании этого можно предположить, что при первичной госпитализации в декабре 2013 г. пациент № 13 был заражен от пациента № 8 штаммом, который циркулировал в тот период времени в стационаре — изолят 419 и который затем был выделен у пациента № 13 (изолят 3962) при госпитализации в феврале 2014 г. У пациента № 13 этот штамм (изолят 3692) вызвал рецидив ППИ через 5 лет, что привело к повторной госпитализации. При поступлении протез был удален (операция Girdlestone) ввиду тяжелого рецидивирующего течения ППИ: к моменту повторной госпитализации пациент уже перенес 12 различных операций по различным медицинским показаниями, не связанных с эндопротезированием.

Среди оставшихся четырех пациентов (№ 5, 13, 6, 9) с повторной инфекцией, вызванной тем же штаммом, были два случая, когда эндопротез был удален из-за неэффективности лечения и рецидива ППИ (рис. 2). У пациента № 5 (изоляты 379, 212 и 264) можно предположить первичное заражение внутрибольничным штаммом во время госпитализации в августе 2012 г. изолятом 153, который был высеян у другого пациента (№ 1), госпитализированного из-за ППИ в июле 2012 г. (изолят 153). Через 2 мес. после купирования ППИ у пациента № 5 произошла реактивация того же штамма (изолят 212) с клиническим проявлением рецидива ППИ. После завершения курса терапии антибиотиками через полгода вновь развился рецидив ППИ (повторная реактивация — изолят 264). В итоге лечение ППИ было неэффективным, и эндопротез тазобедренного сустава был удален. При этом произошло инфицирование пациента № 2 (изолят 406) и пациента № 13 (изолят 399) от пациента № 5 с различием в числе мутаций 39 и 7 соответственно.

 

Рис. 2. Родство геномов исследуемых изолятов с указанием приблизительной даты первичного эндопротезирования соответствующего пациента (треугольник) и госпитализации по причине ППИ (зеленые круги). Пунктирная линия обозначает временную шкалу для каждого пациента. Оранжевые и синие линии — филогенетическое родство двух изолятов с числом отличий в геномах менее и более 100 соответственно. Над каждой такой линией указано число однонуклеотидных замен, инсерций и делеций, отличающих два генома. Минус в круге обозначает удаление эндопротеза, а число — номер изолята

Figure 2. Genetic relatedness of the isolates, indicating the approximate date of primary arthroplasty for the corresponding patient (triangle) and hospital admission due to PJI (green circles). The dashed line represents the timeline for each patient. Orange and blue lines indicate phylogenetic relatedness of two isolates with fewer than and more than 100 genomic differences, respectively. Above each such line, the number of single nucleotide substitutions, insertions, and deletions distinguishing the two genomes is indicated. A minus sign in a circle denotes prosthesis removal, and the number represents the isolate number

 

У пациента № 6 (изоляты 318, 359 и 412) также было проведено два курса антибиотикотерапии. Через 4 мес. после первого эпизода развития ППИ (изолят 359) произошла реактивация того же штамма (изолят 318), при этом геномы отличались по наличию четырех мутаций между геномами бактерий, что клинически проявлялось рецидивом ППИ. Эндопротез был сразу удален (операция Girdlestone) с проведением курса антибактериальной терапии. После хирургической паузы и реэндопротезирования с последующим курсом антибиотикотерапии вновь развился рецидив инфекционного процесса, вызванный тем же штаммом (изолят 412). Об идентичности штаммов говорит небольшое число мутаций. В связи с этим был проведен еще один курс антибиотикотерапии, после которого инфекционный процесс был купирован. При этом новая резистентность к аминогликозидам появилась только у изолята 412 (к гентамицину и тобрамицину благодаря гену aac(6’)-aph(2’’)). У данного пациента (№ 6) была обнаружена филогенетическая связь между изолятами S. aureus с другим пациентом (№ 11), от которого был получен изолят 226, содержащий такие же новые гены антибиотикорезистентности, как и изолят 412, что свидетельствует о том, что все эти изоляты, скорее всего, имели внутрибольничный источник заражения.

У двух других пациентов (№ 2 и № 10) с повторной инфекцией выздоровление было зарегистрировано уже после второго курса антибиотикотерапии. Развившаяся первоначальная инфекция у пациента № 2 (изолят 406), по-видимому, тоже имела внутрибольничное происхождение из-за близкого филогенетического родства с изолятом 264 пациента № 5 (различия между геномами — всего 39 мутаций). После первого этапа терапии цефтриаксоном (1,0 г два раза в сутки) и ванкомицином (1,0 г два раза в день внутривенно) реактивация инфекции произошла только через 4 года и 10 мес. (изолят 1063). Но, учитывая срок развития после операции, допустимо данную клиническую ситуацию рассматривать как самостоятельный гематогенный транслокационный инфекционный процесс. Комбинированная терапия цефтриаксоном (1,0 г два раза в сутки), ванкомицином (1,0 г два раза в день внутривенно), меропенемом (1,0 г три раза в сутки), цефтаролина фосамилом (600 мг два раза в день) и ципрофлоксацином (400 мг два раза в сутки) в стационаре и бисептолом (960 мг два раза в день в течение 3 нед.) с ципрофлоксацином (500 мг два раза в день в течение 3 нед.) на амбулаторном этапе привела к купированию ППИ с сохранением эндопротеза. При этом изолят 1063 по сравнению с изолятом 406 потерял ген blaZ, сохранив устойчивость к β-лактамам и став чувствительным к цефокситину. По-видимому, за такой долгий период произошел отбор на те бактерии, которые не содержат соответствующего гена. Для пациента № 10 в обоих случаях ППИ, вызванных одним и тем же штаммом, был применен цефазолин. После второго курса антибиотикотерапии ППИ была купирована, что, скорее всего, связано с повторной, более радикальной санацией с элементами некрэктомии и заменой парой трения в варианте Double DAIR. Связь между проведенными операциями, филогенетическим родством изолятов и исходом лечения представлена в таблице 4.

 

Таблица 4

Связь между проведенными типами хирургического вмешательства и терапии, филогенетическим родством изолятов, а также исходами лечения пациентов

Филогенетически родственные изоляты выделены одинаковым цветом. DAIR (Debridement, Antibiotics and Implant Retention — метод хирургического лечения ППИ с сохранением имплантата); операция Girdlestone — удаление эндопротеза без установки спейсера; санация – вариант вторичной хирургической обработки раны; хр. остеомиелит — хронический остеомиелит, ППИ инфекция не купирована, рецидивирующее течение; условное выздоровление — купирование ППИ без последующего реэндопротезирования ТБС, при этом конечность опорная с укорочением; выздоровление — после реэндопротезирования тазобедренного сустава в течение 12 мес. рецидива не наблюдается; рец. — рецидив.

 

Состав генов в геномах изолятов с повторной инфекцией

В процессе антибиотикотерапии все изоляты от пациентов с повторной ППИ долгое время находились под интенсивным воздействием антибиотиков, в связи с чем были исследованы изменения в геномах изолятов от одного пациента. У двух пациентов со значительно отличающимся периодом ремиссии (4 года и 10 мес. у пациента № 10 и менее недели у пациента № 2) состав генов не изменился, несмотря на то, что 39 и 35 точечных мутаций, соответственно, отличали геномы изолятов между собой.

У пациента № 6 с выздоровлением по итогу лечения наблюдалась обратная зависимость: число точечных мутаций составило 4 и 1, а число новых генов между изолятами 359–318 и 318–412 составило 2 и 78 соответственно. Среди 78 генов были найдены гены, кодирующие ферменты синтеза полисахаридов капсулы, адгезины, фаговые белки, аминогликозид-N (6’)-ацетилтрансферазу, дающую резистентность к аминогликозидам. При этом один из новых генов изолята 318 (ген, кодирующий белок фиксации (заякоривания) на поверхности клеточной стенки) был найден и в геноме изолята 412, что подтверждает их филогенетическое родство. С другой стороны, остается открытым для дальнейшего исследования вопрос об источнике новых генов в изоляте 412, поскольку большинство из них при анализе с помощью BLAST NCBI находятся в геномах других штаммов S. aureus, что подразумевает горизонтальный перенос этих генов из бактерий того же вида, которые должны были бы контактировать с изолятом, вызвавшим инфекцию.

Изолят 212 от пациента № 5 содержал 7 дополнительных генов, отсутствовавших в геноме изолята 379, среди которых были найдены гены, кодирующие маннитол-1-фосфат-5-дегидрогеназу, D-маннитол-пермеазу фосфотрансферазной системы, фибронектин-связывающий белок и никазу. У этого же пациента геном изолята 264 был секвенирован с глубиной, достаточной для филогенетического анализа, однако недостаточной для аннотации генов de novo. Появление новых генов, повышающих патогенность бактерий и определило, вероятно, рецидивирующее течение ППИ и ее исход в хронический остеомиелит.

Обсуждение

Используя полногеномное секвенирование, нами были исследованы 13 случаев ППИ, вызванных различными штаммами S. aureus, из которых пять были с повторным развитием ППИ (рецидив). Именно случаи с рецидивом инфекции и являлись основным объектом исследования, поскольку их изучение улучшает наше понимание того, каким образом бактерии адаптируются к новым условиям после проведенного лечения [32]. Среди всех антибиотиков наиболее часто (73% госпитализаций) применялся цефазолин в сочетании с другими антибиотиками. При этом в литературе известны случаи так называемого инокулюм-эффекта, когда минимальная ингибирующая концентрация повышается в 4 и более раз при высокой концентрации патогена и наличии в геноме гена β-лактамазы (blaZ), способной с низкой эффективностью гидролизовать молекулы цефазолина [33, 34]. Ген blaZ также был обнаружен у большинства изолятов — (85%), что связано с высоким распространением резистентности штаммов S. aureus к пенициллинам.

Нами был выявлен ряд несоответствий фенотипических проявлений и наличия или отсутствия генетических детерминант. Три изолята, резистентных к гентамицину и тобрамицину и содержащих ген aac(6’)-aph(2’’), были чувствительны к амикацину, что достаточно часто описывается в литературе [35]. В связи с этим стоит с осторожностью относиться к определению антибиотикорезистентности исключительно по молекулярно-генетическому тестированию — результатам полногеномного секвенирования или ПЦР.

Среди собранных 20 изолятов S. aureus наибольшее распространение имели штаммы клонального комплекса 97 (СС97). Многие бактерии этого клонального комплекса часто обнаруживают у сельскохозяйственных животных [28, 29, 30], а для некоторых из них показана возможность перехода от животных к человеку [36, 37, 38]. Нельзя исключать возможность того, что широкое распространение в качестве внутригоспитальной инфекции эти штаммы могли получить тоже после перехода от животных к человеку с каких-либо фермерских хозяйств, тем более среди пациентов, оперированных по поводу коксартроза, половина представлена жителями сельской местности.

Нами была выявлена потенциальная цепочка заражения внутригоспитальным штаммом CC97 с 2011 по 2019 г. нескольких пациентов. Но ввиду того, что для подтверждения ее существования требуется значительно больше изолятов, дальнейшая работа была сфокусирована на повторных инфекциях одних и тех же пациентов. Используя данные полногеномного секвенирования, нам удалось показать, что в четырех из пяти случаев инфекция была вызвана филогенетически родственным изолятом, изменения в геноме которых подтверждает их родство. Появление новых генов антибиотикорезистентности к аминогликозидам наблюдалось только в одном случае из шести, что, по-видимому, связано с применением комбинаций из нескольких антимикробных препаратов, что снижало вероятность одновременного получения клеткой сразу нескольких генов.

Таким образом, используя полногеномное секвенирование, нам удалось показать филогенетическое родство изолятов, полученных на протяженном временном интервале от пациентов с ППИ, в том числе в случае повторной инфекции. Полученные результаты по накоплению изменений в геномах штаммов S. aureus как при впервые выявленных внутригоспитальных инфекциях, так и при рецидиве показывают, что подробное молекулярно-генетическое тестирование может помочь в выборе тактики терапии пациентов в зависимости от того, как в ответ на терапию антибиотиками изменяется геном бактерии.

Помимо изменения тактики антибактериальной терапии, результаты такого тестирования могут повлиять и на тактику хирургического лечения. В случае, если в среде присутствуют бактерии, которые вызывают ППИ и содержат в геноме гены антибиотикорезистентности, полученные в результате горизонтального переноса, тактика лечения ППИ должна быть радикальной. При формировании у бактерий антибиотикорезистентности, когда вынужденно увеличиваются дозы антибиотика для преодоления резистентности с неизбежной индукцией новых мутаций, продолжение двухэтапного курса лечения ППИ с повторными установками спейсера не только теряет смысл, но и создает угрозу формирования мультирезистентных бактерий. В этой ситуации целесообразно не сохранять инфицированный протез, а удалить его (операция Girdlestone), провести полноценную санацию гнойного очага и отказаться от установки спейсера. Отказ от повторной имплантации спейсера уменьшает курсовые дозы локальной и системной антибиотикотерапии, тем самым снижая мутационное давление на возбудители ППИ. Удаление эндопротеза с последующей хирургической паузой (до 6–12 мес.) сокращает сроки терапии антибактериальными препаратами, снижает риски появления новых мутаций, а следовательно, и развития антибиотикорезистентности и повышает эффективность лечения. Последующее ревизионное эндопротезирование после хирургической паузы в этом случае представляется более обнадеживающим.

Заключение

Полученные данные полногеномного секвенирования позволяют выявлять филогенетически родственные изоляты, изменения в геноме которых подтверждают их родство. Выявление факта родства изолятов, выделенных при ранее леченной перипротезной инфекции и при ее рецидиве, указывает на факт реинфекции, вызванной прежними персистирующими изолятами, а не попавшими в рану извне во время реэндопротезирования, что позволяет исключить факт инфекции области хирургического вмешательства как эпидемиологического случая. И, наоборот, в случае родства изолятов у двух и более пациентов можно сделать вывод о непосредственном внутригоспитальном инфицировании. На фоне проводимой высокодозной антибактериальной терапии как в случае впервые выявленной внутригоспитальной перипротезной инфекции, так и при ее рецидиве, в геномах штаммов S. aureus накапливаются изменения, которые при подробном молекулярно-генетическом тестировании с выявлением мутаций в генах, а также вновь приобретенных генов вирулентности и резистентности могут помочь обосновать выбор радикальной тактики лечения перипротезной инфекции — удаление эндопротеза.

Дополнительная информация

Заявленный вклад авторов

Кечин А.А. — анализ и интерпретация данных, написание и редактирование текста рукописи.

Боробова В.С. — анализ и интерпретация данных, написание текста рукописи.

Шералиев Т.У. — сбор данных, редактирование текста рукописи.

Кретьен С.О. — сбор данных, редактирование текста рукописи.

Троменшлегер И.Н. — сбор данных, редактирование текста рукописи.

Павлов В.В. — концепция исследования, редактирование текста рукописи.

Филипенко М.Л. — дизайн исследования, редактирование текста рукописи.

Все авторы прочли и одобрили финальную версию рукописи статьи. Все авторы согласны нести ответственность за все аспекты работы, чтобы обеспечить надлежащее рассмотрение и решение всех возможных вопросов, связанных с корректностью и надежностью любой части работы.

Источник финансирования. Исследование выполнено в рамках государственного задания ФГБУН «ИХБФМ» СО РАН № 125012300671-8.

Возможный конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Этическая экспертиза. Исследование одобрено локальным этическим комитетом ФГБУ «Новосибирский научно-исследовательский институт травматологии и ортопедии им. Я.Л. Цивьяна» Минздрава России, протокол № 011/19 от 20.09.2019 г.

Информированное согласие на публикацию. Авторы получили письменное согласие пациентов на участие в исследовании и публикацию результатов.

 

¹ Российские рекомендации. Определение чувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам. Версия 2024-02. Смоленск: МАКМАХ, СГМУ; 2024. 192 с.

Об авторах

Андрей Андреевич Кечин

ФГБУН «Институт химической биологии и фундаментальной медицины» Сибирского отделения Российской академии наук; ФГАОУ ВО «Новосибирский национальный исследовательский государственный университет»

Автор, ответственный за переписку.
Email: a.a.kechin@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-4822-0251
SPIN-код: 9252-8834

канд. биол. наук

Россия, г. Новосибирск; г. Новосибирск

Виктория Сергеевна Боробова

ФГБУН «Институт химической биологии и фундаментальной медицины» Сибирского отделения Российской академии наук; ФГАОУ ВО «Новосибирский национальный исследовательский государственный университет»

Email: v.borobova@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-4443-3997
Россия, г. Новосибирск; г. Новосибирск

Таалайбек Усеналиевич Шералиев

ФГБУ «Новосибирский научно-исследовательский институт травматологии и ортопедии им. Я.Л. Цивьяна» Минздрава России

Email: sheraliev.taalai@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-7261-2730
Россия, г. Новосибирск

Светлана Олеговна Кретьен

ФГБУ «Новосибирский научно-исследовательский институт травматологии и ортопедии им. Я.Л. Цивьяна» Минздрава России

Email: ssonovo64@inbox.ru
ORCID iD: 0000-0003-0074-8062
Россия, г. Новосибирск

Ирина Николаевна Троменшлегер

ФГБУН «Институт химической биологии и фундаментальной медицины» Сибирского отделения Российской академии наук

Email: irina510@ngs.ru
ORCID iD: 0009-0006-9543-3547
Россия, г. Новосибирск

Виталий Викторович Павлов

ФГБУ «Новосибирский научно-исследовательский институт травматологии и ортопедии им. Я.Л. Цивьяна» Минздрава России

Email: pavlovdoc@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-8997-7330

д-р мед. наук, доцент

Россия, г. Новосибирск

Максим Леонидович Филипенко

ФГБУН «Институт химической биологии и фундаментальной медицины» Сибирского отделения Российской академии наук

Email: max@niboch.nsc.ru
ORCID iD: 0000-0002-8950-5368
SPIN-код: 4025-0533

д-р мед. наук

Россия, г. Новосибирск

Список литературы

Дополнительные файлы