Properties of Calcium Phosphate/Hydrogel Bone Grafting Composite on the Model of Diaphyseal Rat Femur’s Defect: Experimental Study

Ivan M. Shcherbakov; Щербаков Иван Михайлович; Elena S. Klimashina; Климашина Елена Сергеевна; Pavel V. Evdokimov; Евдокимов Павел Владимирович; Andrei A. Tikhonov; Тихонов Андрей Александрович; Valerii I. Putlayev; Путляев Валерий Иванович; Georgii A. Shipunov; Шипунов Георгий Александрович; Vladislav A. Zatsepin; Зацепин Владислав Александрович; Vadim E. Dubrov; Дубров Вадим Эрикович; Natal’ia V. Danilova; Данилова Наталья Владимировна; Pavel G. Malkov; Мальков Павел Георгиевич

doi:10.17816/2311-2905-2039

Оценка свойств костнозамещающих материалов на основе полиэтиленгликоль диакрилата и октакальциевого фосфата на модели монокортикального диафизарного дефекта бедренной кости крысы: экспериментальное исследование

Авторы: Щербаков И.М.¹, Климашина Е.С.¹, Евдокимов П.В.¹, Тихонов А.А.¹, Путляев В.И.¹, Шипунов Г.А.¹, Зацепин В.А.¹, Дубров В.Э.¹, Данилова Н.В.¹, Мальков П.Г.¹
Учреждения:
1. ФГБОУ ВО «Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова»
Выпуск: Том 29, № 1 (2023)
Страницы: 25-35
Раздел: Теоретические и экспериментальные исследования
Дата подачи: 21.12.2022
Дата принятия к публикации: 03.03.2023
Дата публикации: 11.04.2023
URL: https://journal.rniito.org/jour/article/view/2039
DOI: https://doi.org/10.17816/2311-2905-2039
ID: 2039

Цитировать

Полный текст

Аннотация
Полный текст
Об авторах
Список литературы
Дополнительные файлы
Статистика

Аннотация

Актуальность. Проблема замещения дефектов кости актуальна в настоящее время, постоянно ведутся поиски новых синтетических костнозамещающих материалов, однако идеальный материал не найден до сих пор.

Цели исследования: 1) определение пригодности модели монокортикального дефекта диафиза бедренной кости крысы с дополнительным профилактическим армированием при помощи накостной пластины для оценки биологических свойств имплантируемых материалов на примере коммерчески доступного материала сhronOS®; 2) оценка остеокондуктивных свойств композитных материалов на основе полиэтиленгликоль диакрилата и октакальциевого фосфата с архитектурой Кельвина и типа гироид на разработанной модели.

Материал и методы. Монокортикальный дефект диафиза бедренной кости крыс размером 7 мм в длину производили под наркозом в асептических условиях операционной и фиксировали полиэфирэфиркетоновой пластиной и шестью титановыми винтами. Крыс распределяли случайным образом на четыре группы по 12 особей в каждой. В группе «Контроль» у животных костный дефект не заполняли. У животных в группе «Хронос» дефект заполняли подготовленным материалом chronOS® в виде полуцилиндрического блока, в группе «Кельвин» — исследуемым материалом с архитектурой Кельвина, в группе «Гироид» — исследуемым материалом с архитектурой типа гироид. Через 3 и 6 нед. крыс выводили из эксперимента и производили гистологическое исследование зоны дефекта. Затем выполняли гистометрическую оценку количества новообразованной костной ткани с последующей статистической обработкой результатов.

Результаты. В ходе эксперимента все животные достигли планируемой конечной точки, инфекционные осложнения и потеря фиксации зафиксированы не были. При гистологическом исследовании зоны дефекта выявлен минимальный рост кости в группе «Контроль», достаточно медленное образование кости в материале группы «Гироид» и статистически значимо более выраженное образование костной ткани в порах материалов в группах «Кельвин» и «Хронос».

Заключение. Разработанная модель дефекта кости спонтанно не заполняется костной тканью и позволяет проводить изучение биологических свойств костнопластических материалов (способность к биодеградации и остеокондуктивные свойства). Остеокондуктивные свойства композитного материала на основе полиэтиленгликоль диакрилата и октакальциевого фосфата с архитектурой Кельвина выше, чем с архитектурой типа гироид, и сопоставимы с таковыми у материала сhronOS.

Ключевые слова

регенерация костной ткани, критический дефект, гидрогель, костнозамещающие материалы, 3D-печать

Полный текст

ВВЕДЕНИЕ

Создание новых искусственных костнозамещающих материалов актуально, потому что потребность в них высока, однако до сих пор не создано ни универсального материала, удовлетворяющего всем клиническим требованиям, ни набора препаратов с четкими показаниями к применению в различных ситуациях [1, 2, 3, 4]. Развитие наук о материалах позволяет создавать большое количество соединений и композитов с вероятными клиническими свойствами (способность к биодеградации с заданной скоростью, остеокондуктивность, остеоиндуктивность и остеогенность). Однако только теоретически, без проведения исследований на животных моделях, подтвердить или опровергнуть наличие таких свойств невозможно [5, 6, 7].

Одним из перспективных направлений в материаловедении является создание костнозамещающих имплантатов с трехмерной архитектурой пор, позволяющей улучшить остеокондуктивные свойства при сохранении прочностных характеристик [8, 9, 10]. Одним из возможных материалов для заполнения дефектов костей могут быть композиты на основе гидрогелей с добавлением фосфатов кальция с соотношением по массе Сa/P<1,5 (например, октакальциевый фосфат (ОКФ) с химической формулой Ca₈(HPO₄)₂(PO₄)₄·5H₂O)), имеющие бóльшую скорость резорбции по сравнению с гидроксиапатитом и трикальций фосфатом [11, 12]. Увеличение остеокондуктивных свойств свойственно для конструкций со связно-пористой архитектурой и долей пустот по объему более 75% [13]. Но такие параметры ставят задачу поиска их оптимального пространственного взаиморасположения без потери всей системой механической прочности. Одним из возможных путей решения такой задачи может быть применение современных методов топологической оптимизации [14, 15, 16]. Хорошую комбинацию механических свойств и физической проницаемости в расчетах показывают архитектуры Кельвина и типа гироид, однако реальные преимущества каждой их них требуют экспериментального подтверждения [17, 18].

Цели исследования:

1) определение пригодности модели монокортикального дефекта диафиза бедренной кости крысы с дополнительным профилактическим армированием при помощи накостной пластины для оценки биологических свойств имплантируемых материалов на примере коммерчески доступного материала сhronOS®;

2) оценка остеокондуктивных свойств композитных материалов на основе полиэтиленгликоль диакрилата и октакальциевого фосфата с архитектурой Кельвина и типа гироид на разработанной модели.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

Материалы

Исследуемые биорезорбируемые макропористые 3D-конструкции нового поколения представляют собой гидрогелевый композит, наполненный частицами фосфата кальция. В качестве непрерывной фазы композита был применен гидрогель на основе полиэтиленгликоль диакрилата (ПЭГ ДА). В качестве второй фазы композита использовался ОКФ — Ca₈(HPO₄)₂(PO₄)₄·5H₂O.

Для синтеза гидрогелевых композитов использовали фотополимеризуемые суспензии на основе ПЭГ ДА, ОКФ, воды и фотоинициатора по методике, описанной в нашей предыдущей статье [19]. Для формирования вышеуказанных конструкций была выбрана стереолитографическая ЗD-печать с помощью DLP-принтера Ember (Autodesk, США). При этом трехмерные модели структур были созданы с помощью компьютерных программ Monolith (Autodesk, США) и Fusion 360 (Autodesk, США).

Общая пористость созданных материалов по объему составила около 70%, основные каналы имеют размеры 1250 мкм и переходы между ними 750 мкм, что обеспечивает максимальную проницаемость таких архитектур. В процессе компьютерного конструирования для реализации цели исследования были выбраны 3D-модели со структурой Кельвина и типа гироид (рис. 1) [17, 19].

Рис. 1. Изометрическая проекция компьютерных моделей трехмерных структур с различными архитектурами: а — элементарная ячейка структуры Кельвина; b — элементарная ячейка структуры типа гироид; c — цилиндрическая структура с архитектурой Кельвина; d — цилиндрическая структура с архитектурой типа гироид

Структура Кельвина представляет собой плотную упаковку усеченных октаэдров со сквозными каналами, перпендикулярными каждой грани. Структура типа гироид представляет собой минимальную периодическую поверхность [20].

В качестве материала сравнения использовали широко распространенный полностью синтетический керамический материал на основе Ca₃(PO₄)₂ (трикальцийфосфат) сhronOS® (DePuy Synthes, Johnson & Johnson, Швейцария), хаотичная пористость которого формируется путем неконтролируемого вспенивания и застывания исходного материала в промышленных условиях. В этом материале общая пористость по объему составляет около 55%, размер основных пор — 300 мкм, а переходы между ними — 50 мкм.

Животные

Исследование выполнено на 53 самцах крыс Rattus norvegicus линии Wistar в возрасте 25– 30 нед. из ЦКП «SPF-виварий» Института цитологии и генетики СО РАН. Животных содержали в виварии в клетках, по 3 особи в каждой. Доступ к воде и корму был ad libitum.

Дизайн эксперимента, ход хирургического вмешательства, лабораторные исследования

Тип исследования — проспективное, уровень доказательности — II.

Для введения животных в состояние наркоза внутрибрюшинно вводили препараты Золетил 50 (Zoletil, Virbac Sante Animale, Франция) и Ксила (Xyla, Interchemie werken «De Adelaar B.V», Нидерланды) в дозах 6,25/6,25 мг/кг и 4 мг/кг соответственно.

В асептических условиях операционной после достижения хирургической стадии наркоза и очистки зоны операции от шерсти в положении крысы на правом боку на операционном столе производили разрез кожи в проекции бедренной кости длиной 6,0 см. Далее остро и тупо осуществляли доступ к диафизу бедренной кости по латеральной межмышечной перегородке. После выполнения доступа в средней трети диафиза бедренной кости по дорсальной поверхности конической фрезой с алмазным напылением диаметром 2,3 мм с помощью аппарата Marathon-N2 (Saeyang Microtech, Республика Корея) выполняли дефект полуцилиндрической формы длиной 7 мм и радиусом 4 мм (рис. 2 а).

Рис. 2. Вид операционной раны: а — дефект с имплантированным материалом; b — аугментация кости пластиной и винтами

Крыс распределяли случайным образом в четыре группы по 12 особей в каждой. В группе «Контроль» у животных костный дефект не заполняли. У животных в группе «Хронос» дефект заполняли подготовленным материалом chronOS® в виде полуцилиндрического блока, в группе «Кельвин» — исследуемым материалом с архитектурой Кельвина, в группе «Гироид» — исследуемым материалом с архитектурой типа гироид.

Кость армировали пластиной из полиэфиэфиркетона размерами 30,0×4,0×4,5 мм с ее размещением по тыльнолатеральной поверхности бедренной кости и фиксацией 6 титановыми винтами диаметром 1,2 мм, длиной 10 мм (Конмет, Россия), по 3 винта с каждой стороны дефекта (рис. 2 b). После фиксации рану послойно ушивали, повязки не накладывали, иммобилизацию не применяли. Средняя длительность операции составила 39±8 мин. (от 23 до 54 мин.). Объем кровопотери составлял не более 1,0 мл.

Через 3 и 6 нед. после выполнения операции животных выводили из эксперимента по стандартной методике с использованием СО₂-камеры с последующим забором материала (участок бедренной кости с дефектом) для гистологического исследования.

Фиксацию образцов выполняли в 10% нейтральном забуференном формалине на протяжении 24–48 ч. По прошествии этого времени материалы подвергали декальцинации в нейтральном растворе трилона Б 25% комнатной температуры на аппарате Orbital Shaker OS20 (Biosan, Латвия). После выполнения декальцинации по стандартной методике производили промывку в дистиллированной воде, гистологическую проводку и заливку. Далее изготавливали поперечные срезы парафиновых блоков толщиной 3–4 мкм, проводили их окраску гематоксилином и эозином.

Гистометрический анализ

Для оценки результатов проводили слепой гистометрический анализ. Изображения гистологических препаратов получали с помощью светового микроскопа Leica DM LB2 (Carl Zeiss, Германия) и цифровой камеры AxioCam ICc3 (Carl Zeiss, Германия). Оцифрованные изображения переводили в формат JPEG. Гистометрическую оценку проводили с помощью программы Fiji [21] при увеличении в 20 раз с измерением площади новообразованной костной ткани в лакунах материалов в мм². Новообразованную костную ткань определяли по характерной структуре и окраске. При этом учитывали зоны, не связанные с эндостом или толщей кортикальной кости, чтобы избежать включения разрастаний. Для каждого образца проводили вычисление на трех препаратах, всего для каждой группы получалось 18 значений (только для групп «Хронос 3 недели» и «Контроль 6 недель» — 15 значений).

Статистический анализ

Результаты каждой группы представляли в виде среднего, максимального и минимального значений. Для установления статистической значимости различий использовали вычисление непараметрического критерия Краскела – Уоллиса с помощью программы StatSoft Statistica 10.0 (2011) отдельно для групп со сроком вывода 3 нед. и 6 нед.

РЕЗУЛЬТАТЫ

В ходе проведения эксперимента от осложнений, связанных с наркозом, погибло 2 животных. У 4 животных в процессе проведения операции произошел ятрогенный перелом бедренной кости в области дефекта, в связи с чем была выполнена эвтаназия с помощью СО₂-камеры. У одного животного из группы «Хронос» (№ 12) на следующий день после операции из-за агрессии соседей по клетке произошло расхождение послеоперационной раны с обширным дефектом мягких тканей, из-за чего по этическим соображениям выполнена эвтаназия. Остальные животные перенесли оперативное вмешательство и дожили до вывода из эксперимента без особенностей.

В процессе наблюдения за животными масса тела увеличивалась. Средняя масса крыс на момент ввода в эксперимент была 347 г, на момент вывода через 3 нед. — 398 г, через 6 нед. — 445 г. Значимая разница между группами по массе и ее приросту не зафиксирована.

Изменений поведения животных в процессе эксперимента не наблюдали. Все животные в послеоперационном периоде передвигались на четырех лапах без ограничений. У всех животных послеоперационные раны зажили первичным натяжением. Внешних признаков инфекционных осложнений зафиксировано не было. В процессе забора материала при осмотре зоны имплантации также не было зафиксировано признаков нагноения, повреждения или миграции фиксаторов, переломов кости.

В группе «Контроль» на гистологических срезах зона дефекта была заполнена грануляционной соединительной тканью. Формирование трабекул костной ткани, не связанной с эндостом, не отмечено ни через 3, ни через 6 нед., что позволяет считать данный дефект критическим (рис. 3).

Рис. 3. Гистологические препараты поперечных срезов бедренной кости на уровне дефекта (группа «Контроль»): a — через 3 нед.; b — через 6 нед. Окрашивание гематоксилином и эозином. Ув. ×20

В группе «Хронос» на всех препаратах был виден поперечный срез материала прямоугольной формы, внешние линейные размеры которого не менялись через 3 и 6 нед. Неорганическую основу блока идентифицировали как поля ячеистой бледно-серой структуры, не содержащей клеточных и волокнистых элементов. Практически всегда снаружи блок был окружен тонким слоем грануляционной соединительной ткани, при этом выраженной воспалительной реакции (большого количества полиморфноядерных нейтрофилов, макрофагов или гигантских клеток инородных тел) не отмечалось ни через 3, ни через 6 нед.

Через 3 нед. было отмечено прорастание соединительной ткани с клеточными элементами и сосудами в поры по всей толще материала с формированием костных балок по периферии блока (в среднем 25–35 балок на срез). Через 6 нед. отмечено образование костных трабекул в порах по всему объему материала (рис. 4).

Рис. 4. Гистологические препараты поперечных срезов бедренной кости на уровне дефекта (группа «Хронос»): а — через 3 нед.; b — через 6 нед. Окрашивание гематоксилином и эозином. Ув. ×20

В группе «Гироид» на гистологических срезах обратило на себя внимание постоянное наличие округлых пустот, повторяющих контуры имплантируемых блоков материала, содержащих окрашиваемые в коричнево-красный цвет структуры, не содержащих клеточных элементов и волокон различной неправильной формы с наличием постоянных ленточных элементов строения (рис. 5). Эти ленточные структуры были расценены как остатки гидрогеля, из которого изготовлялись блоки материала. На гистологических препаратах через 3 нед. с момента имплантации было отмечено полное заполнение пор материала грануляционной соединительной тканью с образованием трабекул кости, однако через 6 нед. площадь новообразованной кости оказалась меньше, чем в группах «Хронос» и «Кельвин». При этом сам материал и его структура прослеживали на препаратах этого времени с большим трудом.

Рис. 5. Гистологические препараты поперечных срезов бедренной кости на уровне дефекта (группа «Гироид»): а — через 3 нед.; b — через 6 нед. Окрашивание гематоксилином и эозином. Ув. ×20

В группе «Кельвин» на гистологических препаратах также были выявлены зоны округлых пустот, повторяющих контуры имплантируемых блоков материала и содержащих меньшие по площади окрашиваемые в коричнево-красный цвет структуры без клеточных элементов и волокон (рис. 6). Форма этих пустот отличается от таковых на препаратах с имплантированным материалом с архитектурой типа гироид. Остеокондуктивные свойства материала с архитектурой Кельвина были выражены лучше, о чем говорит большая масса костной ткани вокруг материала и в его порах. По сравнению с гистологическими препаратами группы «Хронос» участки костной ткани были больше по площади и повторяли архитектуру пор материала.

Рис. 6. Гистологические препараты поперечных срезов бедренной кости на уровне дефекта (группа «Кельвин»): а — через 3 нед.; b — через 6 нед. Окрашивание гематоксилином и эозином. Ув. ×20

Результаты вычисления площади новообразованной костной ткани во всех группах представлены в таблице 1.

Таблица 1. Распределение по группам исследования показателя площади новообразованной костной ткани

Группа	Срок наблюдения, нед.	Площадь новообразованной костной ткани, мм²
Группа	Срок наблюдения, нед.	Среднее значение	Минимальное значение	Максимальное значение
«Контроль»	3	0,0515	0	0,7070
«Контроль»	6	0,1462	0	0,8350
«Хронос»	3	0,3694	0,0920	0,7760
«Хронос»	6	1,1686	0,1570	3,1230
«Кельвин»	3	0,9107	0	1,8270
«Кельвин»	6	1,2650	0,0870	2,9780
«Гироид»	3	0,0497	0	0,6060
«Гироид»	6	0,0853	0	0,6710

Различия между группами по площади новообразованной костной ткани были статистически значимыми как для срока 3 нед. (Н критерий Краскела – Уоллиса составляет 57,4399, что соответствует p<0,01), так и 6 нед. (Н критерий Краскела – Уоллиса составляет 38,4702, что соответствует p<0,01).

ОБСУЖДЕНИЕ

Для исследования биологических свойств материалов in vivo используются различные модели как по выбору животных (мыши [22], крысы [23, 24, 25, 26, 27], кролики [28], собаки [29], так и по методике имплантации. Очевидно, что дефект для изучения свойств материалов должен быть критическим, то есть не иметь возможности спонтанного замещения. В противном случае наличие материала будет даже замедлять замещение костной тканью и отражать только скорость его биодеградации.

Критические дефекты, описанные в литературе, условно можно разделить на два типа. К первому типу можно отнести дефекты, не требующие в силу своей стабильности дополнительной аугментации, профилактически предотвращающей патологический перелом оперируемой кости (округлые фрезевые дефекты черепа [25, 30, 31], округлые фрезевые дефекты эпифизов бедренной и большеберцовой костей [28]). Ко второму типу относятся дефекты, требующие стабилизации ввиду высокого риска переломов костей при обычной нагрузке — полные сегментарные дефекты бедренной кости, фиксированные штифтом [22], пластиной [32] или аппаратом наружной фиксации [33].

Выполнение исследований на дефектах без аугментации технически проще, однако такие дефекты по биологическим свойствам меньше соответствуют реальным клиническим ситуациям. Изучение сегментарных диафизарных дефектов продиктовано клиническим запросом на восстановление длины укороченной в силу различных причин конечности без использования длительных методик дистракционного остеогенеза или крайне трудоемких переносов трансплантатов на сосудистой ножке. Но такие модели технически сложны для выполнения и могут не подходить в качестве скрининговых. В настоящем исследовании была использована модель монокортикального дефекта диафиза бедра с фиксацией пластиной и винтами. Такой выбор обусловлен необходимостью сочетания критического дефекта диафизарной кости с надежной фиксацией материала в дефекте и обеспечения возможности полноценной локомоции животного в течение периода наблюдения без повышения риска перелома фиксатора и кости.

Предложенная модель создания дефекта продемонстрировала свои возможности, на что указывает отсутствие инфекционных и механических осложнений на сроке наблюдения до 6 нед. в условиях сохранной локомоторной функции крыс. Преимуществами этой модели по сравнению с другими способами фиксации являются размещение фиксатора в тканях и отсутствие элементов наружной фиксации, которые потенциально могут травмировать само животное или соседей по клетке [33]. От интрамедуллярного фиксатора предлагаемая модель отличается незанятостью костномозгового канала фиксатором и отсутствием необходимости размещать материал рядом с костью, что приближает нашу модель к клинической ситуации [22]. От полного дефекта нашу модель отличают простота хирургической техники и возможность надежной фиксации материала в зоне дефекта за счет конгруэнтности форм и прижатия пластиной [32].

Настоящая работа показала, что монокортикальный дефект, как и полный, является критическим, на что указывает отсутствие спонтанного замещения костной тканью зоны резекции в срок 6 нед. Кроме того, предлагаемая биологическая модель пригодна для исследования потенциальных костнозамещающих материалов, о чем свидетельствует выраженное прорастание костной тканью материала chronOS® с подтвержденными остеокондуктивными свойствами.

Второй целью нашей работы было установление влияния двух типов трехмерной архитектуры материала на остеокондуктивные свойства гидрогелей на основе полиэтиленгликоль диакрилата, нагруженных ОКФ. Влияние структуры пористого материала на прорастание костной ткани описано в литературе [18]. В результате исследования можно сделать вывод о превосходстве в плане остеокондуктивных свойств архитектуры Кельвина над архитектурой типа гироид у композитных материалов на основе ПЭГ ДA. Одной из причин этого может быть биологическое взаимодействие тканей с трехмерными порами, приводящее к запуску определенных механотрансдуктивных сигналов и направлению дифференцировки клеток-предшественников по пути остеобластов, лучше выраженное в структуре Кельвина. Дополнительными причинами могут являться более быстрая деградация и потеря прочности механической структуры, что на поздних строках затруднило образование новой кости и по свойствам, вероятно, было сопоставимо с условиями в дефекте группы «Контроль».

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Разработанная модель дефекта кости является критической и позволяет проводить изучение биологических свойств костнопластических материалов (способность к биодеградации и остеокондуктивные свойства). Остеокондуктивные свойства композитного материала на основе полиэтиленгликоль диакрилата и октакальциевого фосфата с архитектурой Кельвина выше, чем с архитектурой типа гироид.

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ

Заявленный вклад авторов

Щербаков И.М. — концепция и дизайн исследования, сбор и обработка материала, написание текста статьи, статистическая обработка данных.

Климашина Е.С. — концепция и дизайн исследования, сбор и обработка материала, редактирование текста статьи.

Евдокимов П.В. — концепция и дизайн исследования, сбор и обработка материала, написание текста статьи.

Тихонов А.А. — концепция и дизайн исследования, сбор и обработка материала, редактирование текста статьи.

Путляев В.И. — концепция и дизайн исследования, сбор и обработка материала, редактирование текста статьи.

Шипунов Г.А. — сбор и обработка материала.

Зацепин В.А. — сбор и обработка материала.

Дубров В.Э. — концепция и дизайн исследования, редактирование текста статьи.

Данилова Н.В. — сбор и обработка материала, написание текста статьи.

Мальков П.Г. — сбор и обработка материала, редактирование текста статьи.

Все авторы прочли и одобрили финальную версию рукописи статьи. Все авторы согласны нести ответственность за все аспекты работы, чтобы обеспечить надлежащее рассмотрение и решение всех возможных вопросов, связанных с корректностью и надежностью любой части работы.

Источник финансирования. Работа выполнена при поддержке РНФ (грант № 17-79-20427).

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Этическая экспертиза. Проведение исследования одобрено Комитетом по биоэтике (№ 82-ж от 25.10.2018). Исследование проведено при соблюдении принципов гуманного обращения с лабораторными животными в соответствии с требованиями Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментов и других научных целей и директивой 2010/63/EU Европейского парламента и Совета Европейского союза от 22 сентября 2010 г. по охране животных, используемых в научных целях.

Информированное согласие на публикацию. Не требуется.

DISCLAIMERS

Author contribution

Shcherbakov I.M. — concept and design of the study, collection and processing of material, writing the draft, statistical analysis

Klimashina E.S. — concept and design of the study, collection and processing of material, text editing.

Evdokimov P.V. — concept and design of the study, collection and processing of material, writing the draft.

Tikhonov A.A. — collection and processing of material, text editing.

Putlayev V.I. — concept and design of the study, collection and processing of material, text editing.

Shipunov G.A. — collection and processing of material.

Zatsepin V.A. — collection and processing of material.

Dubrov V.E. — concept and design of the study, text editing.

Danilova N.V. — collection and processing of material, writing the draft.

Malkov P.G. — collection and processing of material, text editing.

All authors have read and approved the final version of the manuscript of the article. All authors agree to bear responsibility for all aspects of the study to ensure proper consideration and resolution of all possible issues related to the correctness and reliability of any part of the work.

Funding source. The study was supported by the Russian Science Foundation (Grant No 17-79-20427).

Competing interests. The authors declare that they have no competing interests.

Ethics approval. The study was approved by the local Ethics Committee of the Lomonosov Moscow State University (protocol No 82-zh, 25.10.2018). The study was conducted in compliance with the principles of humane treatment of laboratory animals in accordance with the requirements of the European Convention for the Protection of Vertebrate Animals used for Experiments and other Scientific Purposes and Directive 2010/63/EU of the European Parliament and the Council of the European Union of September 22, 2010 on the protection of animals used for scientific purposes.

Consent for publication. Not required.