Оценка биосовместимости новых костнопластических ксеноматериалов, содержащих золедроновую кислоту и ранелат стронция

Полный текст

ВВЕДЕНИЕ

В настоящее время задача улучшения биологических и функциональных характеристик имплантируемых изделий и материалов, используемых в травматологии и ортопедии, является достаточно актуальной проблемой [1, 2, 3, 4]. Основным направлением исследований в этом плане является использование материала/изделия не только как матрикса для образования костной ткани, но и как системы доставки дополнительных биологически активных веществ в зону имплантации [5, 6, 7]. При этом наиболее приемлемым носителем является сама костная ткань, причем как аллогенной, так и ксеногенной природы [8, 9, 10]. В этом плане основные направления модификации костного материала направлены на усиление остеоиндуктивного и остеогенного эффектов. Так, костный матрикс импрегнируют: клетками [11, 12], включая богатую тромбоцитами плазму [13]; факторами роста и цитокинами [14, 15, 16]; неколлагеновыми белками [17]; матричной РНК (мРНК) [18, 19]; лекарственными субстанциями, включая антибактериальные препараты [20, 21, 22, 23]. Для улучшения биологических свойств костного материала модифицируют технологии его физической обработки [24]. В последнее время к биорезорбируемым имплантатам стали предъявлять требование сохранять их механические свойства для обеспечения структурной поддержки кости до момента образования полноценного регенерата, что может быть достигнуто путем импрегнации в объем имплантатов веществ, модулирующих резорбтивную активность, в частности золедронатов и ранелата стронция [25, 26, 27]. Определенные перспективы, по нашему мнению, имеет импрегнация этих веществ в ксеногенную кость как наиболее доступную в плане сырья и возможностей ее модификации [28, 29, 30].

Цель исследования — изучить биосовместимость модифицированных золедроновой кислотой и ранелатом стронция ксеноматериалов из костного матрикса крупного рогатого скота при их имплантации в полость костного дефекта.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

Дизайн исследования

Исследование выполнено на 24 кроликах-самцах породы cоветская шиншилла (питомник ПАО «Синтез»), возраст животных от 8 до 16 мес., масса тела от 3,0 до 4,5 кЖивотным моделировали дефект костной ткани размером 4×4×6 мм. В полости дефектов имплантировали тестируемые блоки ксеноматериала (КМ) аналогичного размера.

Животным группы 1 (n = 8, группа контроля) имплантировали костный (немодифицированный) ксеногенный материал «Матрикс остеопластический “Bio-Ost”» (РЗН 2015/3086) (сырье — губчатые кости крупного рогатого скота). Животным группы 2 (n = 8) имплантировали костный КМ, импрегнированный золедроновой кислотой. Животным группы 3 (n = 8) имплантировали костный КМ, импрегнированный ранелатом стронция. Для получения модифицированных КМ использовали костные блоки размером 20×15×5 мм (Bio-Ost), полилактид (Poly[D,L-lactide] IV дл/г, acid-terminated, молекулярная масса 30 кДа), моногидрат золедроновой кислоты (Zoledronic acid monohydrate, Sigma-Aldrich, США) и стронция ранелат (Strontium ranelate, Sigma-Aldrich, США).

Схема импрегнации

Измельченный полилактид массой 1 г (для золедроната) и 0,5 г (для ранелата) растворяли в 20 мл этилового спирта, выдерживали 3 ч. при температуре 60°С. Далее 50 мг золедроновой кислоты растворяли в 10 мл 0,1н раствора NaOH. Ранелат стронция растворяли в 10 мл дистиллированной воды. Растворы субстанций (золедроновая кислота и стронция ранелат) смешивали с раствором полилактида. Далее в полученный раствор погружали блоки (10 штук). Затем раствор с погруженными в него блоками помещали в реактор установки для сверхкритической флюидной экстракции Waters, подавали углекислый газ и доводили параметры среды до P = 250 атм, t = 32°С [31]. После установки в реакторе статического режима блоки выдерживали 30 мин., после чего выключали подачу углекислого газа, давление сбрасывали в течение 30 мин. Вышедшие блоки лиофилизировали и проводили газовую стерилизацию в среде оксида этанола с последующим вакуумированием и аэрацией в течение 2 сут. Материалы получены на базе ООО «МедИнжБио» (Пенза).

Моделирование дефекта костной ткани дистального метафиза бедренной кости и проксимального метафиза большеберцовой кости

Оперативное вмешательство выполняли под общим обезболиванием (премедикация: р-р димедрола 1% (0,02 мг/кг), р-р атропина сульфата 0,1% (0,02 мг/кг), медитина 1% (0,35 мг/кг), для наркоза: тиопентал натрия 5% (10 мг/кг). Первоначально выполняли оперативный доступ к латеральной поверхности дистального метафиза бедренной кости. Далее стоматологическим бором выполняли выборку костной ткани метафиза, формируя несквозной дефект шириной и длиной по 4 мм и глубиной 6 мм. После этого в полость дефекта помещали имплантат, который устанавливали плотно при помощи легкого вколачивания. Далее послойно, наглухо ушивали операционную рану шовным материалом Vicril 4/0 (Ethicon, США). Оперативный доступ к проксимальному метафизу большеберцовой кости осуществляли на медиальной поверхности голени. Формирование дефекта, установку имплантата и ушивание операционной раны выполняли описанным выше способом. Для профилактики развития септических послеоперационных осложнений в день операции выполняли однократное введение антибактериальных препаратов из группы цефалоспоринов (цефазолин в дозе 200 мг) и нестероидного противовоспалительного лекарственного средства (кетопрофен 0,05% 0,5 мл). Обработку операционного шва не проводили.

У каждого животного выполняли 4 имплантации: дистальный метафиз бедренной кости и проксимальный метафиз большеберцовой кости на обеих конечностях.

После окончания операции для профилактики осложнений послеоперационной гипотермии наркозного сна осуществляли обогрев кроликов под инфракрасной лампой в течение 1–3 ч. при температуре 25–28°С на поверхности тела до полного пробуждения животного. Срок плановой эвтаназии — 84-е и 182-е сут. после имплантации. При выборе сроков наблюдения за животными после имплантации руководствовались ГОСТ ISO 10993-6-2011. Изделия медицинские. Оценка биологического действия медицинских изделий. Часть 6. Исследования местного действия после имплантации.

Содержание животных

Животных содержали в виварии исследовательского центра по одному в индивидуальных клетках площадью 0,5 м² с постоянным доступом к корму и воде. В качестве подстила использовали сено. Кормление осуществлялось по стандартному сбалансированному по питательным веществам рациону, включающему комбикорм для кроликов (ПЗК 90, Богдановичский комбикормовый завод), зерно овса, свежую морковь и сено. Чистая питьевая вода — без ограничений.

Перед поступлением в эксперимент животные проходили карантин в течение 15 дней. В период нахождения животных в карантинном блоке ежедневно контролировали общее состояние кроликов путем осмотра в клетке. Животные с неудовлетворительным общим состоянием были исключены из формирования групп. Животные распределялись по группам случайным отбором.

Каждое животное в группе идентифицировали индивидуальным трехзначным номером. Метод маркировки — татуировка индивидуального трехзначного номера на внутренней поверхности ушной раковины и бирка с аналогичным номером на клетке.

Для оценки биосовместимости, включая безопасность тестируемых материалов, применяли методы прижизненного наблюдения, рентгенологический, патологоанатомический, гистологический и лабораторный методы исследования.

Прижизненные наблюдения

Ежедневно отмечали отклонения в общем состоянии кроликов, их поведение в клетке, наличие хромоты. Оценивали прием корма и воды, цвет шерсти и видимые слизистые оболочки. При осмотре зоны имплантации обращали внимание на состояние операционных ран, появление отеков, истечение экссудата, болезненность.

Рентгенологические исследования

Рентгенологические исследования выполняли в день операции, на 14-е, 28-е, 56-е, 84-е, 112-е, 140-е и 182-е сут. наблюдений. Выполняли рентгенографию зон имплантации в передней, аксиальной и латеро-медиальной проекциях на рентгенологическом аппарате TOSHIBA (Rotanode) Model E7239. N: 10G749 (Япония). Сила тока — 2,5–3,2 мА, напряжение — 43–44 кВ, фокусное расстояние 90 см, выдержка автоматическая.

Патологоанатомические исследования

Плановую эвтаназию животных проводили под премедикацией (димедрол 1% — 0,02 мг/кг), рометар 2% (5 мг/кг) путем передозировки барбитуратов. При аутопсии выполняли осмотр внутренних органов, мест имплантации, определяли относительную массу паренхиматозных органов. Проводили макроскопическое исследование зон имплантации.

Гистологические исследования

Метаэпифизы трубчатых костей, включающие область оперативного вмешательства, фиксировали в течение 3 сут. в 10% формалине для гистологии (Labiko) при pH 6,8–7,4. После кислотной декальцинации в растворе, содержащем 10% концентрированной соляной и 8% концентрированной муравьиной кислот, костные блоки обезжиривали в ацетоне и обезвоживали в этиловом спирте восходящей концентрации от 70% до 100%. Декальцинированные образцы заливали в целлоидин-парафин и секционировали на санном микротоме НМ-450 (Thermo Fisher, Великобритания). Полученные срезы толщиной до 7 мкм окрашивали гематоксилином и эозином и трихромом по Масону. Гистологические препараты сканировали в микроскопе Pannoramic Midi II (3DHISTECH Ltd., Венгрия) с объективом план-апохромат ×40 Corr/NA 0,95. Морфологическое исследование цифровых гистологических препаратов, гистоморфометрию клеточных и тканевых компонентов производили с применением программного продукта Pannoramic Viewer (3DHISTECH Ltd., Венгрия).

Гистоморфометрическое исследование выполняли на цифровых препаратах, полученных с использованием указанного выше аппаратно-программного комплекса для цифровых технологий. На цифровых изображениях гистологических срезов, окрашенных гематоксилином и эозином, гистоморфометрически оценивали клеточный состав и васкуляризацию костного органа в области имплантации. Подсчет количества клеток и сосудов производили в поле зрения 0,01 мм² с цифровым объективом ×100. На цифровых изображениях гистологических препаратов, окрашенных трихромом по Масону, с использованием цифрового объектива ×20 определяли процентную долю площадей новообразованного губчатого костного вещества, соединительной ткани и остеопластического материала. Пластинчатую грубоволокнистую костную ткань и ксеногенный костный матрикс идентифицировали на основании особенностей фиброархитектоники, морфологии костных клеток (остеобластов и остеоцитов), признаков остеонекроза. В губчатом костном веществе ложа имплантата определяли процентную долю площади костной ткани трабекул. Анализировали не менее 30 полей зрения для каждого материала на каждом этапе эксперимента. На основе полученных количественных данных определяли степень раздражающего воздействия биодеградируемых материалов по ГОСТ ISO 10993-6-2011.

По четырехбалльной шкале отсутствие какого-либо типа клеток в поле зрения оценивали в 0 баллов, наличие 1–5 клеток (для многоядерных фагоцитов — 1–2) — в 1 балл, 5–10 (для многоядерных фагоцитов — 3–5) — в 2 балла, обильный инфильтрат — в 3 балла, плотное расположение — в 4 балла. Образец считали: нераздражающим (от ≤0,0 до 2,9 баллов), легким раздражителем (от 3,0 до 8,9 баллов), умеренным раздражителем (от 9,0 до 15,0 баллов), тяжелым раздражителем (>15).

Тканевую реакцию на имплантацию материалов также оценивали по четырехбалльной шкале. Степень неоваскуляризации определяли по количеству капилляров в поле зрения: 1–3, 4–7, широкая и обильная полоса с фибробластными структурами. Интенсивность фиброза оценивали по ширине соединительнотканной прослойки. Подобным образом определяли выраженность жировой инфильтрации, дифференцируя жировые прослойки в соединительной ткани с красным и желтым костным мозгом. Сумму всех показателей в баллах также использовали для расчета раздражающего действия имплантационных материалов.

Итоговым показателем являлся суммарный балл промежуточных результатов оценки клеточной и тканевой реакций на внутрикостную имплантацию образцов. Степень раздражения определяли по суммарной балльной оценке: раздражающее действие (РД) = клеточная реакция (КР) + тканевая реакция (ТР) и по разнице показателей контрольной и опытных групп для соответствующего срока эксперимента (РД Гр1 — РД ГрN 1, 2, 3). При этом отрицательное значение соответствовало нулевой балльной оценке. Образец считали: не раздражающим (от ≤0,0 до 2,9 баллов); легким раздражителем (от 3,0 до 8,9 баллов); умеренным раздражителем (от 9,0 до 15,0 баллов); тяжелым раздражителем (>15).

Лабораторные исследования

Лабораторные исследования (гематология и биохимия крови) проводили до операции, на 14-е, 30-е, 84-е, 182-е сут. после имплантации. Гематологическое исследование крови включало определение лейкоцитов на автоматическом гематологическом анализаторе ProCyte Dx (IDEXX Lab., США). Биохимическое исследование сыворотки крови включало определение концентраций общего белка, мочевины, С-реактивного белка (СРБ), креатинина, глюкозы, общего кальция, неорганического фосфата. Определяли активность щелочной (ЩФ) и тартратрезистентной (костной) кислой (ТрКФ) фосфатазы, аспартатаминотрансферазы (АСТ), аланинаминотрансферазы (АЛТ). Активность ферментов, а также концентрацию субстратов в сыворотке крови определяли на автоматическом биохимическом анализаторе Hitachi/BM 902 (Япония), используя наборы реагентов фирмы Vital Diagnostic (Санкт-Петербург) и Вектор-Бест (Новосибирск).

Статистический анализ

Результаты количественных признаков представлены в таблицах в виде медианы, 1–3 квартилей (Me; Q1–Q3). Нормальность выборок определяли с помощью критерия Шапиро – Уилка. Процедуру статистической оценки значимости отличий показателей внутри исследуемых групп (до/после имплантации) выполняли с применением W-критерия Вилкоксона. Для оценки статистической значимости показателей между группами использовали T-критерий Манна – Уитни. Минимальный уровень значимости (р) принимали равным 0,05. Для расчетов использовали программу анализа данных AtteStat 12.0.5.

Регулирующие стандарты

Исследование выполнено в соответствии с ГОСТ ISO 10993-1-2011. Изделия медицинские. Оценка биологического действия медицинских изделий. Часть 1. Оценка и исследования; ГОСТ ISO 10993-6-2011. Изделия медицинские. Оценка биологического действия медицинских изделий. Часть 6. Исследования местного действия после имплантации; ГОСТ 33215-2014. Руководство по содержанию и уходу за лабораторными животными. Правила оборудования помещений и организации процедур; ГОСТ 33216-2014. Руководство по содержанию и уходу за лабораторными животными. Правила содержания и ухода за лабораторными грызунами и кроликами.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Прижизненное наблюдение

Течение послеоперационного периода у животных всех экспериментальных групп проходило однотипно. После операции общее состояние животных было удовлетворительным. С 1-х по 3-и сут. у животных фиксировали субфебрильную температуру тела в пределах 39,5–39,7°С, аппетит был немного снижен, воду принимали. Слизистые оболочки конъюнктивы глаз и ротовой полости были розовые. В последующие дни температура тела возвращалась в пределы средних значений, аппетит восстанавливался. В течение первых 5–7 сут. в зоне имплантаций отмечали гиперемию кожи и незначительный отек подкожной клетчатки, болезненность при пальпации была умеренная. В дальнейшем признаков воспаления мягких тканей не наблюдали. Заживление операционных ран проходило по первичному натяжению. Животные пользовались конечностями на протяжении всего эксперимента, двигательная и опорная функции были сохранены полностью.

Рентгенологические исследования

Рентгенологически в день операции зоны имплантации у животных всех групп визуализировались хорошо (рис. 1).

 

Рис. 1. Рентгенограммы области имплантации в день операции: a — группа 1 (стрелками обозначена область имплантации); b — группа 2; c — группа 3

Fig. 1. X-rays of the implantation area on the day of the surgery: a — Group 1 (arrows indicate the implantation area); b — Group 2; c — Group 3

 

На 84-е сут. эксперимента в группе 1 в 50% случаев границы между имплантируемым материалом и материнской костью были размыты. Ксеноматериал просматривался только в проксимальном метафизе большеберцовой кости. В группе 2 к этому сроку в 90% случаев имплантат хорошо визуализировался, контур дефекта материнской кости хорошо определялся. В группе 3 к этому сроку в 33% случаев материал полностью резорбировался, граница дефекта костной ткани материнской кости отсутствовала.

На 182-е сут. эксперимента в группе 1 были видны следы имплантируемого материала. В группе 2 к этому сроку эксперимента только появлялись первые рентгенологические признаки перестройки КМ. Отмечали уменьшение объема имплантируемого материала, размытие краевой линии костного дефекта, однако высокая плотность имплантата была сохранена. В группе 3 к этому сроку границы дефекта костей не просматривались (рис. 2).

 

Рис. 2. Рентгенограммы области имплантации, 182-е сут. после имплантации: a — группа 1; b — группа 2; c — группа 3

Fig. 2. X-rays of the implantation area on the 182^nd day after implantation: a — Group 1; b — Group 2; c — Group 3

 

Таким образом, можно отметить, что рентгенологические признаки замещения материала в группах 1 и 3 были сопоставимы и проявлялись к 182-м сут. после имплантации. В группе 2 полного замещения материала к последнему сроку наблюдения не отмечено.

Результаты патологоанатомических исследований

Все животные были подвержены плановой эвтаназии (84-е и 182-е сут. после имплантации). Гибели животных вне плана не зафиксировано. На сроках эвтаназии у животных всех групп при наружном осмотре повреждений кожного покрова и внутренних органов не отмечалось. Относительная масса органов у животных групп 2 и 3 статистически значимо относительно животных группы 1 не отличалась.

В группе 1 на 182-е сут. опыта область имплантации визуализировалась плохо. Граница с материнской костью была сглажена. Поверхность имплантата была покрыта прозрачной, блестящей плотной тканью, сквозь которую просматривалась неравномерная (губчатая) структура имплантата. Свищевых ходов в зоне контакта имплантат-кость не было отмечено.

В группе 2 на 182-е сут. у большинства животных (80%) граница с материнской костью была хорошо видна, поверхность имплантата была мелкобугристая. Имплантат был плотно соединен с материнской костью по всему периметру. На боковой поверхности метафиза бедренной кости наблюдались очаговые объемные хрящевые напластования.

В группе 3 на 182-е сут. у всех животных имплантат был плотно соединен с материнской костью, граница его определялась, поверхность имплантата была шероховатая, частично покрытая хрящевой тканью. Боковая поверхность метафиза бедренной кости была покрыта тонкими хрящевыми напластованиями разлитого характера.

Во всех группах животных область имплантации в метафизе большеберцовой кости была покрыта плотным слоем поверхностной фасции белого цвета. Свищевых ходов, нестабильности в зоне контакта с материнской костью не отмечалось.

Гистологические исследования

Через 84 сут. после имплантации у животных группы 1 активное костеобразование в области моделирования дефекта было отмечено как в пространствах между трабекулами КМ, так и на границе с губчатым костным веществом материнского ложа (рис. 3).

 

Рис. 3. Гистоструктура области имплантации ксеноматериалов на границе с костным ложем. Срок после имплантации 84-е сут. (столбец слева) и 182-е сут. (столбец справа).

Группа 1 — ксеноматериал частично резорбирован, окружен узкой полосой фиброзной ткани (a) и губчатым костным веществом (b). Группа 2 — ксеноматериал инкапсулирован фиброзной тканью, признаки костеобразования и резорбции не выражены (c, d). Группа 3 — трабекулы ксеноматериала окружены широкими тяжами фиброзной ткани, на 84-е сут. преобладает слабая резорбтивная активность (e), на 182-е сут. — остеокондукция, неоостеогенез (f). Парафиновые срезы, окраска трихромом по методу Массона. Ув. ×20. Масштабный отрезок 50 мкм

Fig. 3. Histostructure of the area of xenomaterial implantation on the border with the bone bed. Day 84 (left column) and day 182 (right column) after implantation.

Group 1 — xenomaterial is partially resorbed and surrounded by a narrow band of fibrous tissue (a) and cancellous bone substance (b). Group 2 — xenomaterial is encapsulated by fibrous tissue, signs of bone formation and resorption are not pronounced (c, d). Group 3 — xenomaterial trabeculae are surrounded by wide fibrous tissue bands, weak resorptive activity prevails on the 84^th day (e), osteoconduction, neoosteogenesis — on the 182^nd day (f). Paraffin sections. Masson’s trichrome stain. Mag. ×20. Scale bar = 50 μm

 

Ксеногенный имплантационный материал проявлял свойство остеокондуктивности, являясь основой для прикрепления остеогенных клеток и формирования ими костного матрикса. В некоторых полях зрения на поверхности костных структур обнаруживались 1–2 прикрепленных либо открепленных остеокласта. Резорбции подвергались как новообразованный костный матрикс, так и трабекулы КМ. Промежутки между фрагментами ксеноматрикса и костными трабекулами заполняла хорошо васкуляризированная рыхлая волокнистая соединительная ткань. В ее клеточном составе присутствовали фибробластоподобные клетки, моноциты, макрофаги. Элементы клеточного воспаления были представлены гранулоцитами эозинофильного ряда. Лимфоциты встречались в единичных полях зрения, плазматические клетки, нейтрофильные гранулоциты, некротизированные клетки практически отсутствовали. Губчатое костное вещество ложа имплантата было представлено редкой сетью пластинчатых костных трабекул с жировым костным мозгом в межтрабекулярных промежутках. Поверхность трабекул покрывали покоящиеся клетки, резорбция остеокластами не наблюдалась.

 

Таблица 1. Численность клеток и сосудов в области имплантации (площадь поля зрения 0,01 мм²), медиана (Q1–Q3)

Параметр оценки	84-е сут. имплантации			182-е сут. имплантации
	Группа 1	Группа 2	Группа 3	Группа 1	Группа 2	Группа 3
Остеобласты/ остеоциты	6 (4–8)	0 (0–0)	0 (0–1)	1 (0–1)*	0 (0–0)	2 (1–3)*
Фибробласты/ фиброциты	23 (19–31)	23 (19–26)	41 (34–52)	15 (14–16)*	20 (18–22)*	29 (27–31)*
Остеокласты	0 (0–1)	0 (0–0)	1 (0–1)	0 (0–0)*	0 (0–0)	0 (0–0)*
Моноциты/макрофаги	12 (9–14)	8 (7–9)	21 (17–24)	5 (4–6)*	5 (4–6)*	13 (12–14)*
Эозинофилы	7 (6–10)	11 (9–12)	0 (0–0)	7 (5–9)	11 (9–13)	0 (0–0)
Капилляры	2 (2,0–2,5)	1 (0–1)	1 (1–2)	2 (1–2)*	2 (1–2)	5 (4–6)*

* — статистически значимые различия по сравнению со сроком 84-е сут. при р<0,05.

Полужирным шрифтом выделены статистически значимые различия с группой 1 при р<0,05.

 

В группе 2 фиброзная прослойка отделяла имплантат от границы костного дефекта. Трабекулы КМ определялись в окружении обширных полей слабо васкуляризированной рыхлой неоформленной соединительной ткани. В ее клеточном составе обнаруживались фибробластоподобные клетки, моноциты, большое количество эозинофильных гранулоцитов. Лимфоциты, плазматические клетки, нейтрофильные гранулоциты, некротизированные клеточные элементы были единичными. Остеогенез наблюдался лишь аппозиционно на поверхности трабекул материнского костного ложа. Резорбция остеопластического материала, как и трабекул губчатого костного вещества, зафиксирована не была.

В группе 3 активное костеобразование отмечалось по периферии костного дефекта и в губчатом костном веществе ложа трансплантата. В межтрабекулярных пространствах новообразованного костного вещества определялся красный костный мозг с включением адипоцитов. Трабекулы КМ окружали прослойки васкуляризированной рыхлой неоформленной соединительной ткани с высокой клеточной плотностью. В составе соединительной ткани преобладали фибробластоподобные клетки и элементы моноцитарно-макрофагального ряда. Лимфоциты, плазматические клетки, полиморфноядерные лейкоциты, включая эозинофилы, некротизированные клеточные элементы присутствовали в незначительном количестве. В центральной части имплантата обнаруживались отдельные новообразованные грубоволокнистые трабекулы, частично контактирующие с трабекулярной сетью имплантата. Имплантационный материал резорбировался остеокластами, в отдельных полях зрения наблюдали до 3–5 прикрепленных, но чаще открепленных многоядерных фагоцитов.

Через 182 сут. после имплантации в группе 1 отмечали органотипическое восстановление губчатого костного вещества в области моделирования дефекта с сохранением микроочагов фиброза и неоостеогенеза. В очагах фиброза отмечалось повышенное содержание эозинофилов. Имплантационный материал подвергался биодеградации, замещаясь губчатым веществом с редкой сетью пластинчатых костных трабекул и красным либо желтым костным мозгом межтрабекулярных пространств. Новообразованные костные трабекулы включали микрофрагменты КМ. Область имплантации окружал желтый костный мозг с редкими гипопластичными костными трабекулами без признаков ремоделирования.

В группе 2 область имплантации была заполнена слабо васкуляризированной волокнистой соединительной тканью, полностью окружающей структурные элементы КМ, без признаков остеогенной активности. Резорбция КМ многоядерными фагоцитами не наблюдалась. Сохранялась интенсивная эозинофильная инфильтрация области дефекта. На границе с областью имплантации отмечали уплотнение трабекулярной сети костного ложа. В ее межтрабекулярных промежутках располагался желтый костный мозг с многочисленными очагами кроветворения. Остеокластно-остеобластное ремоделирование пластинчатых костных трабекул не было отмечено.

В группе 3 область моделирования костного дефекта заполняли губчатое костное вещество и тяжи хорошо васкуляризированной соединительной ткани, инкапсулирующие фрагменты КМ. В клеточном составе соединительной ткани преобладали фибробластоподобные клетки, моноциты, макрофаги. Клетки лейкоцитарного и лимфоидного ряда, некротизированные клетки практически не определялись. Наблюдали плотные контакты фрагментов КМ и отдельных костных трабекул без интеграции имплантационного материала в состав костного матрикса. На поверхности фрагментов КМ сохранялись многочисленные лакуны резорбции, однако прикрепленные остеокласты были редкой находкой. Массивные новобразованные костные трабекулы на границе с губчатым веществом костного ложа были выстланы активными остеобластами. На их поверхности обнаруживались немногочисленные резорбционные лакуны и прикрепленные остеокласты.

Описанные явления были статистически подтверждены результатами гистоморфометрического исследования (табл. 1). Было выявлено достоверное преобладание остеобластов/остеоцитов и капилляров в зоне имплантации у животных группы 1 на 84-е сут. и группы 3 — на 182-е сут. эксперимента. Остеокласты преобладали в группе 3 на 84-е сут. эксперимента. Фибробласты/фиброциты и моноциты/макрофаги в значительной степени присутствовали в зоне имплантации у животных группы 3. Элементы клеточного воспаления были представлены исключительно эозинофильными гранулоцитами и стабильно присутствовали в тканях области имплантации животных группы 2. В группе 3 тканевая эозинофилия была полностью подавлена.

 

Таблица 2. Доля площади тканевых компонентов и ксеноматериала в области моделирования дефекта, медиана (Q1–Q3), %

Компонент	84-е сут. имплантации			182-е сут. имплантации
	Группа 1	Группа 2	Группа 3	Группа 1	Группа 2	Группа 3
Губчатое костное вещество	14 (14–14)	0 (0–0)	27 (25–31)	79 (56–73)*	0 (0–0)	67 (57–65)*
Соединительная ткань	73 (72–74)	73 (71–75)	53 (48–63)	17 (15–19)*	77 (75–78)*	23 (19–28)*
Ксеноматериал	13 (12–14)	27 (24–29)	15 (12–20)	4 (2–5)*	23 (22–25)*	15 (12–17)

* — статистически значимые различия по сравнению со сроком 84-е сут. при р<0,05.

Полужирным шрифтом выделены статистически значимые различия с группой 1 при р<0,05

 

Анализ количественного соотношения площади тканевых компонентов и структурных элементов КМ в области имплантации также выявил статистически значимые различия между группами (табл. 2). Площадь новообразованной костной ткани в области моделирования дефекта у животных групп 1 и 3 существенно возрастала к 182-м сут. после имплантации (до 70%), тогда как в группе 2 к данному сроку максимальную площадь занимала соединительная ткань (значимо превышая аналогичные показатели группы 1 и 3). Относительная площадь фрагментов КМ на гистологических препаратах на 182-е сут. имплантации была максимальна у животных группы 2, минимальна — у животных группы 1.

Оценка плотности губчатого костного вещества ложа имплантата путем определения общей доли костной ткани трабекул показала, что импрегнация материалов как золедроновой кислоты, так и ранелата стронция многократно увеличивала значение данного показателя. Проявление данного эффекта было статистически значимым как на 84-е, так и на 182-е сут. эксперимента и более выраженным — в группе с применением золедроновой кислоты (табл. 3).

 

Таблица 3. Доля площади костной ткани трабекул в губчатом костном веществе ложа имплантата, медиана (Q1–Q3), %

84-е сут. имплантации			182-е сут. имплантации
Группа 1	Группа 2	Группа 3	Группа 1	Группа 2	Группа 3
5 (3–14)	36 (38–44)	17 (8–25)	3 (0–14)	26 (14–33)*	15 (7–28)

* — статистически значимые различия по сравнению со сроком 84-е сут. при р<0,05.

Полужирным шрифтом выделены статистически значимые различия с группой 1 при р<0,05.

 

Показатель клеточной реакции в группе 2 на 182-е сут. после имплантации был значимо выше относительно значений групп 1 и 3 (табл. 4).

 

Таблица 4. Оценка раздражающего воздействия имплантационного материала, медиана (Q1–Q3), баллы по ГОСТ ISO 10993-6-2011

Параметр	84-е сут. имплантации			182-е сут. имплантации
	Группа 1	Группа 2	Группа 3	Группа 1	Группа 2	Группа 3
Реакция клеток
Эозинофилы	2 (2–2)	3 (2–3)	0 (0–0)	2 (2–2)	3 (2–3)	0 (0–0)
Лимфоциты	1 (0–1)	1 (0–1)	1 (0–1)	1 (0–1)	1 (0–1)	1 (0–1)
Прочие лейкоциты (полиморфноядерные гранулоциты, плазматические клетки)	0 (0–1)	0 (0–1)	0 (0–1)	0 (0–1)	0 (0–1)	0 (0–1)
Моноциты/макрофаги	3 (2–3)	2 (2–2)	3 (2–3)	1 (1–2)	2 (2–2)	3 (2–3)
Многоядерные фагоциты	0 (0–1)	0 (0–0)	0 (0–1)	0 (0–0)	0 (0–0)	0 (1–0)
Некроз	0 (0–0)	0 (0–0)	0 (0–0)	0 (0–0)	0 (0–0)	0 (0–0)
Реакция тканей
Неоваскуляризация	1 (1–1)	1 (0–1)	1 (1–1)	1 (1–1)	1 (1–1)	1 (1–1)
Фиброз	2 (2–2)	4 (4–4)	1 (1–1)	1 (0–1)	3 (3–3)	0 (1–0)
Жировой инфильтрат	0 (1–0)	0 (0–0)	0 (1–0)	0 (1–0)	0 (0–0)	0 (1–0)
Показатели раздражающего действия
Клеточная реакция (∑×2)	12 (12–14)	12 (10–12)	8 (6–8)	8 (8–8)*	12 (10–12)	8 (6–8)*
Тканевая реакция	3 (2–3)	5 (5–5)	2 (2–3)	2 (1–2)*	4 (4–4)	1 (1–1)*
Раздражающее действие (клеточная реакция + тканевая реакция)	15 (15–17)	17 (15–17)	10 (9–10)	10 (9–10)*	16 (14–16)	9 (7–9)*
РД Гр1-РД ГрN 1, 2, 3	0	2	-5	0	6	-1

* — статистически значимые различия по сравнению со сроком 84-е сут. при р<0,05.

Полужирным шрифтом выделены статистически значимые различия с группой 1 при р<0,05.

 

Показатель тканевой реакции был наиболее высоким в группе 2 на всем протяжении эксперимента. Анализ суммарной балльной оценки раздражающего действия изученных материалов показал, что на 84-е сут. после имплантации КМ проявлял свойства умеренного раздражителя, однако его действие ослабевало к 182-м сут. эксперимента для всех групп. При этом импрегнация золедроновой кислотой значимо усиливала раздражающее действие КМ на всем протяжении эксперимента. Комбинация с ранелатом стронция, напротив, значимо снижала раздражающее действие КМ, переводя его в категорию легких раздражителей к 182-м сут. эксперимента.

Лабораторные исследования

Статистически значимое повышение уровня лейкоцитов относительно дооперационных значений отмечалось на 14-е сут. эксперимента у животных группы 3 (табл. 5).

 

Таблица 5. Лабораторные показатели кроликов на разных сроках после имплантации, медиана (Q1–Q3)

Показатель	Группа	До операции	14 сут.	30 сут.	84 сут.	182 сут.
Лейкоциты, 109/л	1	7,7 (7,1–8,0)	7,8 (7,4–7,9)	7,4 (6,8–7,8)	7,6 (6,9–9,3)	7,1 (6,6–7,4)
	2	7,6 (7,2–9,3)	8,2 (7,9–8,3)	7,0 (6,6–7,4)	8,2 (8,1–9,5)	7,0 (5,8–8,1)
	3	7,6 (6,6–8,4)	10,6* (9,9–12,9)	8,9 (8,2–11,6)	8,8 (8,0–10,4)	7,0 (6,9–8,0)
Эритроциты, 1012/л	1	6,4 (6,1–6,9)	5,7* (5,3–6,0)	6,6 (6,1–6,7)	6,6 (6,3–7,0)	6,8 (6,4–6,9)
	2	6,4 (5,6–6,8)	5,6* (4,7–6,0)	6,0 (5,9–6,3)	6,5 (5,4–6,9)	6,4 (6,1–7,1)
	3	6,1 (4,8–6,9)	5,4* (5,9–6,3)	6,9 (6,1–7,0)	6,3 (6,0–6,9)	6,7 (6,3–7,0)
Тромбоциты, 109/л	1	379 (303–465)	509 (476–542)	446 (425–497)	438 (392–461)	387(370–448)
	2	397 (326–466)	464 (388–490)	464 (388–490)	308 (290–410)	369 (346–471)
	3	343 (330–393)	410 (389–435)	464 (408–490)	390 (360–470)	359 (316–400)
СРБ, мг/л	1	0,0 (0,0–0,9)	0,0 (0,0–2,4)	0,4 (0,0–2,5)	0,0 (0,0–1,9)	0,0 (0,0–1,0)
	2	0,0 (0,0–0,2)	0,9 (0,0–5,8)	3,6 (2,1–4,6)*	0,0 (0,0–0,2)	0,0 (0,0–0,0)
	3	0,0 (0,0–0,8)	0,0 (0,0–0,3)	0,0 (0,0–0,8)	0,0 (0,0–1,0)	0,0 (0,0–0,0)
ЩФ, Е/л	1	55 (43–67)	55 (50–57)	40 (37–49)	41 (33–48)	53 (50–57)
	2	57 (49–68)	36 (22–48)*	24 (20–34)*	31 (23–39)*	65 (55–71)
	3	62 (50–68)	67 (55–75)	57 (41–68)	50 (39–58)	59 (53–62)
ТрКФ, Е/л	1	26 (23–27)	23 (22–25)	23 (21–25)	20 (17–25)	18 (16–19)*
	2	26 (22–28)	14 (11–18)*	12 (9–14)*	13 (11–19)*	14 (11–17)*
	3	27 (24–30)	27 (24–29)	27 (22–29)	25,8±3,6	21 (20–21)*

* — статистически значимые различия по сравнению с дооперационным уровнем при р<0,05.

Полужирным шрифтом выделены статистически значимые различия с группой 1 при р<0,05.

 

Снижение уровня эритроцитов относительно дооперационных значений на 14-е сут. эксперимента отмечалось у животных всех групп. У животных группы 2 отмечен значимый рост уровня СРБ на 30-е сут. эксперимента. Обнаружено снижение активности ЩФ на отдельных сроках эксперимента у животных группы 2 относительно дооперационных значений и показателей группы 1. Активность ТрКФ на отдельных сроках эксперимента у кроликов группы 2 была ниже, чем в группе контроля. Статистически значимых изменений концентраций общего кальция, неорганического фосфата, общего белка, креатинина и мочевины, а также активности трансаминаз в сыворотке крови животных всех групп на сроках эксперимента не отмечалось.

Таким образом, в лабораторных показателях крови кроликов в ходе исследования не было выявлено значимых сдвигов, характер которых бы указывал на длительное неблагоприятное воздействие препаратов, используемых для насыщения костных блоков.

 

Таблица 6. Нежелательные явления у кроликов всех групп, число наблюдений

Нежелательное явление	Группа 1 (n = 8)	Группа 2 (n = 8)	Группа 3 (n = 8)
Миграция имплантата под кожу	2 2/32*	0	0
Артрит коленного сустава	1	0	0
Рост СРБ и лейкоцитоз	1	1	1
Всего	4 (50%)	1 (13%)	1 (13%)

* — относительно числа имплантаций.

 

Сводные данные о нежелательных явлениях, отмеченных в ходе эксперимента, представлены в таблице 6. У двух животных группы 1 наблюдалась незначительная миграция под кожу в области имплантации в метафиз бедра по одному образцу имплантируемого материала. Миграция произошла из-за того, что имплантат был изготовлен меньшего размера, чем сформированный дефект, что не позволило ему плотно зафиксироваться в кости. У одного кролика развился артрит коленного сустава. Во всех группах у одного из животных отмечали рост СРБ на фоне лейкоцитоза на 14–30-е сут. после имплантации.

ОБСУЖДЕНИЕ

В ходе выполненных нами исследований по оценке биосовместимости костнопластических КМ, содержащих в своем объеме фармакологические субстанции, включая рентгенологические, патологоанатомические, гистологические и лабораторные исследования, обнаружено, что биосовместимость всех тестированных материалов можно оценить как приемлемую: не наблюдалось иммунологического отторжения ксеногенного материала с участием лимфоцитов, а также цитотоксических эффектов. При этом материалы, содержащие золедроновую кислоту и ранелат стронция, показали лучшую фиксацию в дефекте; для них, в отличие от контроля, не было зафиксировано миграции имплантата. Аналогичная особенность отмечена ранее и для алломатериалов, содержащих золедроновую кислоту [32].

Тканевой и клеточный состав области имплантации ксеногенного костного матрикса, импрегнированного антирезорбтивными препаратами, был различным и значимо отличался от контроля. Имплантат костной ткани не был полностью иммунологически нейтральным, оказывая местное умеренно раздражающее действие, выражающееся в слабой эозинофилии и моноцитарно-макрофагальной инфильтрации соединительной ткани в межтрабекулярных промежутках остеопластического материала. Данная реакция обусловлена типичным иммунологическим ответом на ксенотрансплантацию и является залогом как выработки толерантности, так и успешного приживления инородного материала [33].

Импрегнация золедроновой кислотой оказывала пролонгированное антирезорбтивное воздействие как на сам ксеногенный костный матрикс, так и на губчатое костное вещество ложа трансплантата, что привело к увеличению их трабекулярной плотности в сравнении с контролем. Аналогичный эффект обнаруживали ранее при обработке костных аллотрансплантатов и титановых имплантатов золедроновой кислотой. Вместе с тем способность золедроновой кислоты влиять на остеогенный потенциал в области имплантации, по всей видимости, является дозозависимой и на сегодняшний день дискутабельна [34, 35].

Золедроновая кислота также усиливала местное раздражающее действие ксеногенного матрикса, выражающееся в повышенной эозинофилии и фиброзировании области трансплантации. Согласно полученным ранее данным, подобный эффект мог быть следствием приобретения макрофагами фенотипа M1 под влиянием золедроновой кислоты [36], что привело к дисбалансу поляризации макрофагов между провоспалительным (М1) и противовоспалительным (М2) фенотипами, а в результате — к активизации регуляторной функции эозинофилов и локальному фиброзу.

Известно, что отличительным свойством ранелата стронция при системном и локальном применении является не только ингибирование костной резорбции, но и стимуляция остеогенеза [37]. Поэтому импрегнация ксеногенного костного матрикса ранелатом стронция ожидаемо повышала долю новообразованной костной ткани в области трансплантации и плотность трабекулярной сети костного ложа. Снижение значений показателя раздражающего действия имплантационного материала в данной группе экспериментов можно связать с изученным ранее влиянием ранелата стронция на поляризацию макрофагов в направлении противовоспалительного фенотипа М2. Однако присутствие ранелата стронция в области трансплантации также приводило к дисбалансу фенотипов макрофагов М1 и М2, что могло индуцировать умеренный фиброз в области имплантации [38].

Вследствие указанных причин восстановление органотипического строения костного дефекта с деградацией и перестройкой имплантированного в него материала с полным замещением дефекта происходило в разных группах с различной скоростью. Как золедроновая кислота, так и ранелат стронция проявили способность повышать плотность губчатого костного вещества материнского ложа трансплантата, более выраженную при использовании золедроновой кислоты. Однако костный матрикс, импрегнированный ранелатом стронция, на момент окончания эксперимента не показал статистически значимого изменения скорости резорбции относительно контрольного материала (чистый матрикс), а материал с золедроновой кислотой продемонстрировал замедление резорбции трансплантата и замещение его костной тканью.

Последнее наблюдение нужно оценивать в контексте описанного опыта клинического применения костнопластических материалов. Так, в работе Y. Fillingham и J. Jacobs указывается, что непосредственный контакт трансплантата с принимающей костью, а также наличие механической нагрузки на него являются необходимым условием для успешного функционирования костных трансплантатов [39]. Поэтому требования к костным имплантатам в части сохранения биомеханических свойств в целях структурной поддержки кости является важной его характеристикой, но являющейся обратной стороной требованиям к скорости его биорезорбируемости. В этом плане некоторые исследования показывают, например, что в клинической практике неудачи при использовании алломатериалов вызваны быстрой и полной деградацией материала [40]. В этом направлении имеется целая серия исследований, в которых золедронаты используются в качестве модификаторов, препятствующих избыточной резорбции костнопластического материала, содержащего стимуляторы остеогенеза (как правило, это факторы роста) [41, 42].

В целом же экспериментальные исследования показывают, что антиостеорезорбтивные свойства золедронатов могут найти свое применение для улучшения остеоинтеграции имплантируемых изделий и материалов (как металлических, так и природных) [43, 44]. Область клинического применения костнопластических материалов, содержащих золедронаты, обозначены в ранней работе M. Sørensen с соавторами, в которой отмечено, что такой материал может быть полезным для обеспечения ранней стабильности эндопротезов при ревизионном эндопротезировании без какого-либо неблагоприятного влияния на формирование кости [34]. Кроме того, повышенная устойчивость костнопластических материалов к резорбции может быть использована в случаях замещения крупных дефектов, когда требуется сохранение биомеханических характеристик имплантируемого матрикса трансплантата более длительное время [45].

Дополнительным моментом при анализе времени резорбции материалов может быть и тот факт, что, как показывает опыт клинического применения алломатериалов, аллотрансплантаты могут сохраняться и полностью не резорбироваться спустя много лет после трансплантации [46].

Безопасность и переносимость изученных материалов, согласно полученным нами данным, также можно оценить как приемлемую. В частности, обнаружено, что имплантация всех материалов не вызывала у животных признаков отторжения, интоксикации (как локальной, так и системной), длительной системной воспалительной реакций в течение всего срока наблюдения, хотя отдельный раздражающий местный эффект наблюдался до 182-х сут. после имплантации материала, импрегнированного золедроновой кислотой. Также не наблюдалось инфицирования материала и иных серьезных нежелательных реакций на тестируемые материалы. Данное наблюдение говорит о положительном моменте, т.к. в других исследованиях применимость КМ ограничена повышенным иммунным ответом на его имплантацию [47].

В целом же, как показывает наше исследование и имеющийся литературный материал, перспективы применения модифицированного золедронатом костнопластического ксеногенного материала присутствуют. Такое расширение свойств костнопластических материалов может быть вполне оправдано, т.к. увеличивает возможности выбора материала хирургом [48].

Импрегнирование стронция ранелата в материал не вызвало значимых отличий по сравнению с контролем, что можно связать с его низкой биодоступностью из ксеноматрикса. В этом плане, возможно, нам удалось бы обнаружить эффекты применения стронция ранелата в случае более длительного срока наблюдения после имплантации. Однако имеющиеся литературные данные демонстрируют, что приемлемая биодоступность стронция ранелата достигается при его имплантации в матрицу из искусственных материалов [25, 49].

В целом КМ, импрегнированные ранелатом стронция и золедроновой кислотой, можно рекомендовать к замещению костных дефектов, расположенных вне полости суставов. Ввиду более длительной перестройки их можно также использовать для замещения дефектов костной ткани сегментов, несущих высокую опорную нагрузку.

Ограничения исследования

Ограничением данного исследования является размер выборок экспериментальных животных, однако полученные результаты могут быть использованы в части выработки показаний к применению костнопластических материалов, импрегнированных изученными субстанциями.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Костнопластические материалы на основе ксеноматрикса из костей крупного рогатого скота, насыщенные золедроновой кислотой и стронцием ранелатом, имеют приемлемые значения биосовместимости, включая показатели безопасности. Учитывая обнаруженные биологические характеристики разработанных материалов, считаем возможным их дальнейшее применение в случаях замещения крупных дефектов кости и ревизионного эндопротезирования.

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ

Заявленный вклад авторов

Стогов М.В. — концепция или дизайн исследования, сбор и обработка данных, анализ и интерпретация результатов исследования, написание текста статьи.

Дюрягина О.В. — концепция или дизайн исследования, сбор и обработка данных, анализ и интерпретация результатов исследования.

Силантьева Т.А. — концепция или дизайн исследования, сбор и обработка данных, анализ и интерпретация результатов исследования, критическое редактирование текста статьи.

Шипицына И.В. — концепция или дизайн исследования, сбор и обработка данных, анализ и интерпретация результатов исследования, критическое редактирование текста статьи.

Киреева Е.А. — концепция или дизайн исследования, сбор и обработка данных, анализ и интерпретация результатов исследования, критическое редактирование текста статьи.

Степанов М.А. — концепция или дизайн исследования, сбор и обработка данных, анализ и интерпретация результатов исследования, критическое редактирование текста статьи.

Все авторы прочли и одобрили финальную версию рукописи статьи. Все авторы согласны нести ответственность за все аспекты работы, чтобы обеспечить надлежащее рассмотрение и решение всех возможных вопросов, связанных с корректностью и надежностью любой части работы.

Источник финансирования. Исследование выполнено в рамках государственного задания по науке исследовательского центра.

Возможный конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Этическая экспертиза. Исследование выполнено при соблюдении принципов гуманного обращения с лабораторными животными в соответствии с требованиями Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментов и других научных целей и Директивой 2010/63/EU Европейского парламента и Совета Европейского союза от 22 сентября 2010 по охране животных, используемых в научных целях. На проведение исследования получено одобрение локального комитета по этике ФГБУ «НМИЦ ТО им. акад. Г.А. Илизарова» (протокол № 2 (57) от 17.05.2018).

Информированное согласие на публикацию. Не требуется.

DISCLAIMERS

Author contribution

Stogov M.V. — concept or design of the study, collection and processing of a material, the interpretation of the data, the drafting of the manuscript.

Dyuryagina O.V. — concept or design of the study, collection and processing of a material, the interpretation of the data.

Silant’eva T.A. — concept or design of the study, collection and processing of a material, the interpretation of the data, the drafting of the manuscript.

Shipitsyna I.V. — concept or design of the study, collection and processing of a material, the interpretation of the data, critical revision of the manuscript.

Kireeva E.A. — concept or design of the study, collection and processing of a material, the interpretation of the data, critical revision of the manuscript.

Stepanov M.A. — concept or design of the study, collection and processing of a material, the interpretation of the data, critical revision of the manuscript.

All authors have read and approved the final version of the manuscript of the article. All authors agree to bear responsibility for all aspects of the study to ensure proper consideration and resolution of all possible issues related to the correctness and reliability of any part of the work.

Funding source. State budgetary funding.

Disclosure competing interests. The authors declare that they have no competing interests.

Ethics approval. The study was conducted in compliance with the principles of humane treatment of laboratory animals in accordance with the requirements of the European Convention for the Protection of Vertebrate Animals used for Experiments and other Scientific Purposes and Directive 2010/63/EU of the European Parliament and the Council of the European Union of September 22, 2010 on the protection of animals used for scientific purposes. The study was approved by the local ethics committee of National Ilizarov Medical Research Centre for Traumatology and Ortopaedic, protocol No 2 (57), 17.05.2018.

Consent for publication. Not required.

Об авторах

Максим Валерьевич Стогов

ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр травматологии и ортопедии им. акад. Г.А. Илизарова» Минздрава России

Автор, ответственный за переписку.
Email: stogo_off@list.ru
ORCID iD: 0000-0001-8516-8571
SPIN-код: 9345-8300
Scopus Author ID: 26024482600
ResearcherId: N-5847-2018

доктор биологических наук, доцент, руководитель отдела доклинических и лабораторных исследований

Россия, 640014, Курган, ул. М. Ульяновой, д. 6

Ольга Владимировна Дюрягина

ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр травматологии и ортопедии им. акад. Г.А. Илизарова» Минздрава России

Email: diuriagina@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-9974-2204
SPIN-код: 8301-1475
Scopus Author ID: 56105040400
ResearcherId: AAB-3838-2021

кандидат ветеринарных наук, зав. экспериментальной лабораторией

Россия, 640014, Курган, ул. М. Ульяновой, д. 6

Тамара Алексеевна Силантьева

ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр травматологии и ортопедии им. акад. Г.А. Илизарова» Минздрава России

Email: tsyl@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-6405-8365
SPIN-код: 9942-7011
Scopus Author ID: 55543818800
ResearcherId: O-8458-2018

кандидат биологических наук, зав.лабораторией морфологии

Россия, 640014, Курган, ул. М. Ульяновой, д. 6

Ирина Владимировна Шипицына

ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр травматологии и ортопедии им. акад. Г.А. Илизарова» Минздрава России

Email: ivschimik@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-2012-3115
SPIN-код: 3039-5202
Scopus Author ID: 55891336600
ResearcherId: AAH-1004-2020

кандидат биологических наук, научный сотрудник отдела доклинических и лабораторных исследований

Россия, 640014, Курган, ул. М. Ульяновой, д. 6

Елена Анатольевна Киреева

ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр травматологии и ортопедии им. акад. Г.А. Илизарова» Минздрава России

Email: ea_tkachuk@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-1006-5217
SPIN-код: 9598-0838
Scopus Author ID: 56716612200
ResearcherId: G-9986-2018

кандидат биологических наук, старший научный сотрудник отдела доклинических и лабораторных исследований

Россия, 640014, Курган, ул. М. Ульяновой, д. 6

Михаил Александрович Степанов

ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр травматологии и ортопедии им. акад. Г.А. Илизарова» Минздрава России

Email: m-stepanov@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-1331-8897
SPIN-код: 3325-8710
Scopus Author ID: 55302983500
ResearcherId: GZM-6775-2022

кандидат ветеринарных наук, ведущий научный сотрудник экспериментальной лаборатории

Россия, 640014, Курган, ул. М. Ульяновой, д. 6

Список литературы

Дополнительные файлы